专利名称：一种植物源抗灰霉蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物农药领域，尤其涉及一种植物源抗灰霉蛋白及其应用。
背景技术：
化学农药的长期使用己经造成严重后果农产品和土壤中的农药残留量越来 越高，使农产品产量和质量严重下降，导致同过量摄入农药有关的疾病发病率的 升高；有益生物的密度极度下降，自然群落遭到了严重的破坏；病原菌和害虫的 抗药性普遍提高；化学农药的超量使用，导致农产品生产成本逐年提高，加重了 农民的负担。随着人们环保意识的日益增强，化学农药将被逐步淘汰，取而代之 的是生物农药，因其不污染环境、对人和动植物安全、选择性强、病原菌和害虫 难以产生抗药性，而受到世界各国的高度重视，被誉为"绿色农药"，是今后农药 发展的理想选择。目前，在我国农药施用中，生物农药所占的比例仅占1%左右， 且效价低、品种少。真菌病害是威胁农作物生产的自然灾害之一，这种病害严重 发生时，可造成农作物大幅度减产和农作物品质变劣，甚至引起人畜中毒，严重 影响国民经济和人民生活。生产上80%以上的植物病害是由真菌侵染引起的，因 此研究抗真菌植物病害的生物农药是成功防治植物病害的基础和关键。
灰霉病是蔬菜、果树和花卉上一种常见的重要病害。灰霉病的病原为半知菌 亚门的灰葡萄孢(Botrytiscinema)，该病菌寄主范围广，是温室和露地栽培普遍发 生的病害，也是产后贮藏和运输过程中的主要病害。近年来，保护地蔬菜灰霉病 日趋严重，导致烂果烂叶，产品质量下降，损失严重。灰霉病也是葡萄、草莓、 猕猴桃生产中危害最大的病害之一，主要危害果实，对产量和质量影响很大，是 制约葡萄、草莓、猕猴桃生产发展的一大病害，更是产后贮藏过程中的毁灭性病 害。灰霉病还是大棚花卉的重要病害，严重时可引起大量落花落叶，降低观赏价 值。随着保护地种植面积的增加，灰霉病给生产带来的危害日益突出。灰霉病自 上个世纪的八十年代开始逐渐加重，目前已经成为影响我国果蔬产业健康发展的 主要病害之一
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。 因此，本发明的目的是提供一种植物源抗灰霉蛋白。 本发明的再一目的是提供包含上述蛋白的生物农药。 本发明的再一 目的是提供上述抗灰霉蛋白的应用。
本发明的抗灰霉蛋白可以从桑寄生(桑寄生科)、葛根(豆科)中提取。 根据本发明的抗灰霉蛋白，通过以下方法制备
1) 抽提，将植物材料放入搅拌器里，加冷的PBS提取缓冲液，然后放 入4°C;
2) 低温离心，收集上清液；
3) 沉淀蛋白，向步骤2)中获得的上清液中加入硫酸铵，离心得到沉 淀物；
4) 纯化得到抗灰霉蛋白。
根据本发明的蛋白，其中，步骤1)可以重复1 3次，合并各次得到 的上清液，用于沉淀。
根据本发明的蛋白，其中沉淀蛋白的步骤3)可以具体包括以下步骤
a) 向步骤2)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到20%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液；
b) 向步骤a)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到40%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液；
c) 向步骤b)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到60%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液；以及
d) 向步骤c)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到80%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液。根据本发明的蛋白，其中，在步骤4)中，纯化方法为疏水层析、亲和 层析和/或离子交换层析。
本发明还提供了包含上述抗灰霉蛋白的生物农药。
本发明还提供了上述抗灰霉蛋白的应用。
本发明的抗灰霉蛋白不仅能明显抑制灰霉孢子的萌发而且能明显抑制 灰霉菌丝的生长。因此，本发明的蛋白可以有效地应用于植物灰霉病的防治， 并可以作为一种安全、高效的生物农药。
图1 A D显示了本发明的蛋白抑制灰霉萌发的结果，其中，A显示水作 为对照，灰霉孢子正常萌发；B显示缓冲液作为对照，灰霉孢子正常萌发； C显示蛋白样品明显抑制灰霉孢子的萌发；在图1D中，左侧为对照缓冲液， 右侧为蛋白样品对灰霉的抑制效果。
图2显示本发明的蛋白的离体叶片检测实验结果，其中，2号、9号蛋 白和经20%、 40%硫酸铵沉淀获得的样品抗灰霉活性明显，对照受到灰霉侵 染。
具体实施例方式
实施例l制备本发明的抗灰霉蛋白
1、 抽提，称取500克桑寄生，放入搅拌器里，加冷的(4'C)提取缓冲 液(0.15mol/lNaCL+0.01mo1磷酸缓冲液)，即PBS150ml (pH7.2)，在搅拌 过程中再加两次提取缓冲液各150ml，最后用50ml提取缓冲液洗掉搅拌器
壁上的碎末，然后放入4t:冰箱过夜。
2、 4'C下离心，10000rpm， 30分钟，上清液放入4。C。
3、 沉淀蛋白
1)用冷的提取缓冲液500ml抽提沉淀物，4'C下离心，10000rpm， 30 分钟。将两次离心所得的上清液混合，或放入4'C，或直接用两层纱布过滤 上清液(呈褐色)，在4'C条件下，上清液共1200ml，加入硫酸铵(北京化
5工试剂厂生产)，到达20%的硫酸铵饱和度，加入硫酸铵的上清液颜色由褐 色变黑色，4X:下离心，10000rpm， IO分钟，将得到的沉淀物放入1.5ml的 eppendorf管里，用提取缓冲液将离心管壁上的沉淀物洗入eppendorf管里，
2) 得到的上清液用硫酸铵沉淀，在上清液中，加入硫酸铵，达到40% 的硫酸铵饱和度，4'C过夜，4'C下离心10000rpm， 10分钟，将得到的沉淀 物分别放入1.5ml的eppendorf管里，用提取缓冲液将离心管壁上的沉淀物 洗入eppendorf管里，贮于-20。C;
3) 得到的上清液用硫酸铵沉淀，在上清液中，加入硫酸铵，达到60% 的硫酸铵饱和度，4。C过夜，4'C下离心，10000rptn， 10分钟，将得到的沉 淀物分别放入1.5ml的eppendorf管里，用提取缓冲液将离心管壁上的沉淀 物洗入eppendorf管里，贮于-20 °C ;
4) 上清液用硫酸铵沉淀，在上清液中，加入硫酸铵，达到80%的硫酸 铵饱和度，4'C过夜，4'C下离心，10000rpm， 10分钟，得到沉淀物。
5) 将各级(20%， 40%， 60%和80%)硫酸铵沉淀物分别溶在PBS缓 冲液(0.15MNaCL+0.01mo1磷酸缓冲液)中，pH7.2，沉淀物PBS=1: 5， 即lg沉淀物+5mlPBS，然后将溶解物放入透析袋中，在同样的PBS缓冲液 中进行透析大约5个小时一换透析液，透析过夜，得到由不同浓度硫酸铵沉 淀的粗蛋白一-2(TC保存，最好冷冻成干粉；
6) 用疏水层析、亲和层析和离子交换层析的方法进一步纯化该硫酸铵 沉淀组份，用其饱和的沉淀组份经提取缓冲液充分透析后的蛋白样品进行抗 灰霉活性检测。
实施例2抗灰霉蛋白的活性检测
应用硫酸铵分级沉淀的方法，又经疏水层析得到的蛋白有明显的抗真菌 --灰霉病菌(Botritis cinerea)活性。
1、供试菌株来源供试灰霉病菌(Botritis cinerea)是由采自于抚顺市 大棚番茄灰霉病果上分离而得，经人工接种鉴定有较强的致病力。2、 抑制孢子萌发法供试蛋白样品共十四个，对照两个(缓冲液和水， 参见图1A、 B)。每个处理进行五次重复。根据对孢子萌发的抑制程度(孢
子萌发率)来确定该样品抑菌活性的强弱，其中有两个样品的孢子萌发率很
低(0， 10%)。试验表明，供试蛋白样品不仅能明显抑制灰霉孢子的萌发而 且能明显抑制灰霉菌丝的生长(参见图1C，和图1D)。
3、 离体叶片检测法供试蛋白样品共六个，对照两个(一个为缓冲液;
一个为灭菌无离子水)。植物材料为黄瓜(品种为长春密刺)的离体叶片， 每个处理进行五次重复。根据菌落扩散直径确定该样品抑菌活性的强弱，其
中有四个样品抑菌活性强(参见图2)。
权利要求
1、一种植物源抗灰霉蛋白，其特征在于，所述蛋白通过以下方法制备1)抽提，将植物材料放入搅拌器里，加冷的PBS提取缓冲液，然后放入4℃；2)低温离心，收集上清液；3)沉淀蛋白，向步骤2)中获得的上清液中加入硫酸铵，离心得到粗蛋白；4)纯化得到抗灰霉蛋白。
2、 根据权利要求1所述的抗灰霉蛋白，其特征在于，步骤1)可以重 复1 3次，合并各次得到的上清液，用于沉淀。
3、 根据权利要求1所述的抗灰霉蛋白，其特征在于，沉淀蛋白的步骤 3)包括以下步骤a) 向步骤2)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到20%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液；b) 向步骤a)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到40%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液；c) 向步骤b)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到60%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液；以及d) 向步骤c)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到80%硫酸铵饱和度， 离心得到粗蛋白和上清液。
4、 根据权利要求1所述的抗灰霉蛋白，其特征在于，在步骤4)中， 纯化方法为疏水层析、亲和层析和/或离子交换层析。
5、 包含权利要求1所述的抗灰霉蛋白的生物农药。
6、 权利要求1所述的抗灰霉蛋白的应用。
全文摘要
本发明涉及生物农药领域，尤其涉及一种植物源抗灰霉蛋白及其应用。本发明的抗灰霉蛋白经PBS提取缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、纯化获得。本发明还提供了包含上述蛋白的生物农药。本发明的抗灰霉蛋白不仅能明显抑制灰霉孢子的萌发而且能明显抑制灰霉菌丝的生长。
文档编号C07K14/415GK101456907SQ20081021217
公开日2009年6月17日 申请日期2008年9月10日 优先权日2007年12月12日
发明者都晓伟, 黄其满 申请人:中国农业科学院生物技术研究所;黄其满