专利名称：可高产复合酶的硫色曲霉及其诱变筛育方法和固态发酵制备饲用复合酶的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及可高产复合酶的硫色曲霉及其诱变筛育方法和固态发酵制备饲用复合酶的应用。
背景技术：
近几十年来，由于人口的迅速增加和生活水平的不断提高，对肉禽蛋的需求量也在逐年提高。饲料是畜禽的食物，如何提高饲料的利用率和动物的生长性能、如何保护环境、保障饲料工业和农牧业的持续、健康、稳定发展已成为人类迫切需要解决的重要问题。
由微生物发酵生产的饲用复合酶是一类无毒、无害、无污染残留的绿色饲料添加剂，在饲料中添加适量的与饲料日粮相匹配的酶制剂能明显提高饲料利用率，减少对环境的污染。
微生物发酵生产酶制剂的关键技术主要由二条一是如何诱变筛选获得高产酶的菌种；另一条是如何选择合适的培养条件使菌种发挥最佳的生产性能。
本发明以选育饲用复合酶高产菌种为突破口，采用符合我国国情的固态发酵法进行规模化生产；不仅提高经济效益，同时也保护生态环境，推动我国畜牧业持续、健康、稳定地发展。
发明内容
本发明的目的是选育一种能高产木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶等复合酶的硫色曲霉；本发明的另一目的是提供一种诱变筛育可高产复合酶的硫色曲霉的方法；本发明的再一目的是将该可高产复合酶的硫色曲霉用于固态发酵制备饲用复合酶中的应用。
本发明的技术方案如下本发明提供的可高产复合酶的硫色曲霉，其特征在于，该可高产复合酶的硫色曲霉为一种能高产木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶的曲霉菌，孢子呈灰红色，其分类命名为硫色曲霉 Aspergillus sulphureus，于2001年8月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.0608。
本发明提供的可高产复合酶的硫色曲霉的诱变筛育方法，其特征在于，诱变选育过程为
1.出发菌种的筛选将从辽宁省锦州市太和郊区的大豆耕地中所取土样制成浓度为10-5的菌悬液，接种在121℃下高压灭菌15-20分钟的固体马铃薯琼脂培养基上，28-32℃下，恒温培养2天，分离获得1株曲霉菌；所述固体马铃薯琼脂培养基配比为去皮马铃薯100-130克、干酪素4-6克、小麦粉15-24克、琼脂16-20克、蒸馏水1000ml、青霉素3-6ppm，pH6.8-7.0；2.以得到的该株曲霉菌为出发菌株进行下述步骤的诱变筛育(1)将得到的该株曲霉菌用无菌生理盐水制备成孢子菌悬液，其孢子数在106-107个/ml之间，液层的厚度为0.3-0.5cm，进行二次紫外诱变，紫外诱变所用紫外灯功率为15W，照射距离为20cm；第一次紫外诱变的紫外照射时间为5分钟，第二次紫外诱变的紫外照射时间为10分钟，照射后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养2天，挑选30-50个单菌落，用于下一步γ射线诱变；(2)进行γ射线诱变γ射线来源于Co60，待处理菌悬液的孢子数在105-106个/ml，照射剂量为600-800居里；诱变后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养2天，挑选30-50个单菌落，用于下一步NTG药物诱变剂处理孢子；(3)NTG药物诱变剂处理孢子NTG药物诱变剂的浓度为150-200ppm，待处理菌悬液的孢子数在105-106个/ml，作用时间为20-30分钟，作用温度为30-40℃；诱变后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养2天，挑选3040个单菌落；将挑选的该30-50个单菌落，分别做摇瓶试验，并测定其酶活力，选择2-3株产酶最高的菌株；再分别对其做摇瓶试验，并测定其酶活力，选择1株产酶最高的菌株；3.将步骤2中的步骤(3)得到的1株产酶最高的菌株作为出发菌株，3-5次循环重复进行与上述步骤3的(1)-(3)相同的诱变选育过程，最后得到一株本发明的可高产复合酶的硫色曲霉菌，该菌保存在固体斜面培养基上，该固体斜面培养基的配方为NaNO30.2-0.4％、KCl0.03-0.06％、KH2PO40.08-0.12％、FeSO40.001-0.002％、MgSO40.03-0.06％、蔗糖2.0-3.5％、琼脂1.8-2.0％、pH值6.6-6.8，培养温度28-30℃，培养时间5-6天；孢子呈灰红色，斜面菌种在4℃条件下保藏，6个月转接一次。
本发明的可高产复合酶的硫色曲霉，其分类命名为硫色曲霉Aspergillussulphureus；于2001年8月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.0608。
经测定分析，本发明的可高产复合酶的硫色曲霉(Mafic-001)固态发酵能同时产生酸性蛋白酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶，而且三种酶的活力都很高。
本发明的可高产复合酶的硫色曲霉应用于固态发酵制备饲用复合酶。
本发明的优点本发明的可高产复合酶的硫色曲霉为一种可产酸性蛋白酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶复合酶的高产酶，可用于固态发酵制备饲用复合酶，配制畜禽饲料，能明显提高饲料的利用率，增强畜禽抗病能力，降低养殖物的污染物排放，具有较好的经济效益和积极的环保意义。
实施例2，用本发明提供的可高产复合酶的硫色曲霉固态发酵制备饲用复合酶的中试(日产200kg成曲)培养基配方和培养温度同上；发酵方式采用托盘式，托盘为0.45×0.30m2的长方形曲盘；料厚为0.015m；起始含水量为58％，成曲含水量为43％；在中试发酵室内，温度和湿度的控制较三角瓶培养困难，水分的挥发比三角瓶料曲高，所以托盘中料曲的起始含水量较高。
中试生产过程的有关参数及注意事项中试生产采用托盘式发酵法，托盘为木框结构30×45cm，底部用金属丝网；在110℃蒸料保温60分钟，然后冷却，降温至35℃时接入种曲；料曲的起始含水量为55-65％，过高会导致料层通风透气困难，过低则会导致菌体过早衰老，从而影响产酶量；接种量在0.5-1.0％之间，充分翻拌，使种曲均匀地混合在大料中，大料接种后装入托盘，平铺均匀，曲料的厚度控制在1.5-2cm，曲房内托盘之间的高度间隔为15cm；发酵过程采用全进全出式。大曲接种后，保持曲房温度在30℃左右，经过10-12小时以后，料曲开始升温(即品温上升)，表明菌体开始大量增殖，18-20小时后达到高峰，此时需要注意降温，同时又要注意保持曲房内空气有较高的相对湿度(一般控制在90％以上)，因为如果湿度降低，料曲的水分含量就要下降，菌体生长下降，甚至停止，从而导致酶活下降。最终成熟料曲的水分含量在30-40％之间；发酵进行到30小时以后，菌体的生长速度逐渐下降，发酵产热也降低，菌体开始产生孢子，酶活开始急剧增加；发酵到48小时以后，酶活的增长速度逐渐下降，72小时以后酶活增加很少；曲房出料以后需要及时清洗，然后进行杀菌消毒，以确保下一批料正常发酵，不受污染；出曲后及时清洗托盘、在消毒液中浸泡24小时，然后晒干或在紫外灯下晾干。
实施例3，用本发明提供的可高产复合酶的硫色曲霉菌固态发酵制备饲用复合酶的规模化(日产2吨成曲)生产培养基配方和培养温度同上，接种量为0.2-0.5％(重量比)，发酵方式采用托盘式，托盘为0.65×0.45m2的长方形曲盘；料厚为0.025m；起始含水量为56％，成曲含水量为45％由于料层加厚，发酵过程中曲温的控制有一定的困难，需要及时通风散热。但是通风容易导致水分散失，酶活下降。所以在生产过程中如何控制温度，同时保持较高的相对湿度是获得理想生产成绩的关键之一。
上述三种固态发酵生产饲用复合酶的结果见表2；表2实验室 中试规模化生产酸性蛋白酶(u/g) 13000 11000 10000木聚糖酶(u/g)90000 82000 73000β-葡聚糖酶(u/g) 56000 48000 43000上述实施例制得的可高产复合酶的硫色曲霉菌，可用来固态发酵制备饲用复合酶，配制畜禽饲料，能明显提高饲料的利用率，增强畜禽抗病能力，降低养殖物的污染物排放，具有较好的经济效益和积极的环保意义。
下面介绍酶活力的测定方法(一)β—葡聚糖酶的测定方法1.酶活定义β—葡聚糖酶酶活在40℃、pH5.0的条件下，每分钟内水解β-葡聚糖生成1μg葡萄糖所需要的酶量为1个酶活单位，以u表示。
2.试剂0.5％(w/w)β—葡聚糖底物称取0.5克β—葡聚糖(Sigma公司)，用10ml乙醇湿润。加入80ml蒸馏水，加热、煮沸。继续搅拌、加热煮沸，直到β—葡聚糖溶解，获得混浊液。冷却混浊液到室温。继续搅拌，用蒸馏水定容至100ml。用玻璃纤维纸过滤。底物能立即使用。在冰箱中储存，有效期为2天。
0.1M醋酸钠缓冲液，pH5.0A液；用蒸馏水溶解8.2克无水醋酸钠，定容至1000ml。
B液用蒸馏水溶解6.0克冰醋酸，定容至1000ml。
用A液调节B液至pH5.0DNS试剂用800ml蒸馏水溶解20.0克3，5——二硝基水杨酸，逐步加入300mlNaOH溶液(含32.0克NaOH)，同时不断搅拌。水浴(温度不超过48℃)，同时不断搅拌，直到溶液透明清澈。再逐步加入600克酒石酸钾钠，水浴(温度不超过48℃)，直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至2000ml，用烧结陶瓷玻璃过滤器过滤。室温下存储在棕色瓶中，有效期6个月。
3.标准曲线配制浓度为10mg/ml的标准溶液称取1克无水葡萄糖，用pH5.0的缓冲溶液定容至100ml。标准葡萄糖溶液的浓度范围在0.1-0.6mg/ml之间。
吸取1ml葡萄糖标准溶液、1ml缓冲液和3mlDNS溶液，加入到试管中，震荡，精确煮沸5分钟。然后在冷水中冷却到室温，在540nm时测定吸光度。空白样是以1ml缓冲液代替1ml葡萄糖溶液，每个数据做2个重复，取平均值。绘制葡萄糖浓度与吸光度的关系曲线。对每一次新配制的DNS试剂，都要重新绘制标准曲线。
4.测定步骤酶样的制备在40℃用0.1MpH5.0的醋酸钠缓冲液溶解酶样，溶解稀释到适当浓度。吸取1ml酶液，加入1mlβ—葡聚糖溶液。震荡，在40℃精确保温10分钟。加入3mlDNS试剂，搅拌煮沸5分钟。用冷水冷却至室温，以蒸馏水为对照在540nm处测定吸光度。
酶的空白对照吸取1mlβ—葡聚糖底物，在40℃精确保温10分钟。加入3mlDNS试剂和1ml酶液。搅拌煮沸，在试管中加入1mlβ—葡聚糖底物、3mlDNS试剂，加热煮沸3分钟。加入1ml经过适当稀释的酶液(pH值5.0)，继续煮沸2-3分钟。冷却至室温，以蒸馏水为对照，在540nm处测定吸光度ODB值。为提高测量精度，ODE值和ODB值的差值应控制在0.3-0.7之间。
5.酶活计算A=[(ODE-ODB)×K+Co]×Dft×1000(u/g)]]>A样品酶活，K标准曲线的斜率，Co标准曲线的截距，Df样品酶的稀释倍数，t反应时间(min)，ODE样品的吸光度，ODB空白样的吸光度。
(二)木聚糖酶活力的测定1.酶活定义木聚糖酶酶活在40℃、pH5.0的条件下，每分钟内水解木聚糖生成1μg木糖所需要的酶量为1个酶活单位，以u表示。
2.试剂0.1M醋酸——醋酸钠缓冲液，pH5.0A液用蒸馏水溶解8g无水醋酸钠，并定容至1000ml。
B液用蒸馏水溶解6.2g冰醋酸，并定容至1000ml。
用B液调节A液的pH值至5.0。
0.5％(w/w)木聚糖底物溶液用10ml浓度为0.5M的NaOH溶液溶解0.5g木聚糖(Sigma公司)，磁力搅拌30分钟，再加入40ml醋酸——醋酸钠缓冲液。用1M的醋酸溶液调节pH值至5.0，用醋酸——醋酸钠缓冲液定容至100ml。
使用前适当摇匀。如果储存在冷藏室，有效期为2天。
DNS试剂在800ml蒸馏水中溶解20.0g3，5——二硝基水杨酸，缓慢加入300mlNaOH溶液(内含NaOH32.0g)。加入时不断搅拌，温水浴(温度不超过48℃)，直到溶液清澈。此时再缓慢加入300g酒石酸钾钠、5g重蒸酚和5g无水亚硫酸钠，温水浴(温度不超过48℃)，并不断搅拌，直到溶液清澈。加蒸馏水定容至2000ml，用烧结玻璃过滤器过滤，清液存储在棕色瓶中，有效期6个月。
3.标准曲线称取1g无水木糖，用pH5.0浓度为0.05M的醋酸钠缓冲液溶解定容到100ml，制成浓度为10mg/ml的木糖储备液。
适当稀释10mg/ml的木糖储备液，配制成浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6(单位mg/m1)的木糖溶液。分别在不同试管中各移取2ml上述6种不同浓度的木糖溶液，再分别添加DNS试剂5ml，沸水浴5分钟，然后水浴中冷却至室温，加入2ml浓度为1.0％的木聚糖底物溶液，定容至25ml，在540nm处测定吸光度OD值。在空白样中用2ml醋酸——醋酸钠缓冲液替代2ml木糖溶液。以吸光度OD值为横轴，木糖浓度为纵轴，绘制标准曲线。每次更换DNS试剂，标准曲线也需要重新绘制。
4.样品酶活的测定酶与底物反应液的吸光度ODE值吸取2ml经过适当稀释的酶液(用醋酸——醋酸钠缓冲液平衡pH值至5.0)，40℃水浴5分钟。加入2ml木聚糖底物溶液(事先已经过40℃水浴)，充分混合。在40℃精确保温30分钟。加入5mlDNS试剂，沸水浴5分钟，然后冷却至室温，定容至25ml。以蒸馏水为对照，在540nm处测定反应液的吸光度ODE值。
空白值的吸光度ODB值在试管中加入2ml木聚糖底物、5mlDNS试剂，沸水浴3分钟。加入2ml经过适当稀释的酶液(pH值5.0)，继续沸水浴2-3分钟，冷却至室温，定容至25ml。以蒸馏水为对照，在540nm处测定吸光度ODB值。为提高测量精度，ODE值和ODB值的差值应控制在0.3-0.7之间。
5.酶活计算A=[(ODE-ODB)×K+Co]×Dft×1000(u/g)]]>A样品酶活，K标准曲线的斜率，Co标准曲线的截距，Df样品酶的稀释倍数，t反应时间(min)。(三)酸性蛋白酶活力的测定1.酶活定义酸性蛋白酶酶活在40℃、pH3.0的条件下，每分钟内水解酪蛋白溶液，产生1μg酪氨酸所需要的酶量为1个酶活单位，以u表示。
2.试剂福林试剂在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85％的磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时。加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸馏水50ml。混匀，取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色。若溶液有绿色，需再加数滴液溴，再蒸沸除去。冷却后定容至1000ml。过滤，置于棕色瓶中，使用时再加1倍蒸馏水稀释。
0.4M的TCA溶液称取65.4g三氯乙酸，加蒸馏水定容至1000ml0.8M的碳酸钠溶液称取无水碳酸钠84.8g，加蒸馏水溶解，定容至1000mlpH3.0的醋酸缓冲液称取10gNaAc·3H2O，加水800ml，溶解。再加入浓度为6M的醋酸溶液，调节pH至3.0，用蒸馏水稀释定容至1000ml。
0.2％的酪蛋白溶液称取酪蛋白(Merck公司)0.2g，置于烧杯中，用少量蒸馏水湿润。然后加入50mlpH3.0的醋酸缓冲液。60℃磁力搅拌，溶解成透明状液体。冷却后再用醋酸缓冲液定容至100ml。
100μg/ml酪氨酸溶液精确称取100mg酪氨酸，用醋酸缓冲液定容至1000ml。
3.绘制标准曲线分别吸取0、2、5、10、20、35、50ml浓度为100μg/ml的酪氨酸溶液，用醋酸缓冲液定容至100ml。获得浓度分别为0、2、5、10、20、35、50μg/ml的酪氨酸溶液。
分别吸取上述酪氨酸溶液各2ml，再加入已经稀释的福林试剂2ml和0.8M的碳酸钠溶液10ml。混匀，在40℃保温20分钟，然后在660nm处进行比色测定。以酪氨酸浓度为Y轴，以吸光度为X轴，绘制标准曲线。
4.样品酶活的测定称取酶粉2g，充分碾细，加蒸馏水100ml。磁力搅拌30分钟，使酶蛋白充分溶出。过滤，滤液用醋酸缓冲液稀释到适当倍数。
取滤液1ml，40℃水浴预热2min，再加入经过同样预热的酪蛋白1ml。精确保温10min。然后立即加入2mlTCA溶液以终止反应。继续置水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀。然后离心分离或过滤，取滤液2ml，再加已经稀释的福林试剂2ml和0.8M的碳酸钠溶液10ml。混匀，在40℃保温20分钟，然后在660nm处进行比色测定。
5.酶活计算蛋白酶活力＝A×4×N/10A对照标准曲线得出的酪氨酸，44ml反应液取出1ml，N酶粉的稀释倍数，10反应时间10min。
权利要求
1.一种可高产复合酶的硫色曲霉，其特征在于，其分类命名为硫色曲霉Aspergillus sulphureus，于2001年8月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.0608。
2.按权利要求1所述的可高产复合酶的硫色曲霉，其特征在于，该可高产复合酶的硫色曲霉菌为一种能高产木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶的曲霉，孢子呈灰红色。
3.权利要求1所述可高产复合酶的硫色曲霉的诱变筛育方法，其特征在于，诱变选育过程为1)出发菌种的筛选将从辽宁省锦州市太和郊区的大豆耕地中所取土样制成浓度为10-5的菌悬液，接种在121℃下高压灭菌15-20分钟的固体马铃薯琼脂培养基上，28-32℃下，恒温培养2天，分离获得1株曲霉菌；所述固体马铃薯琼脂培养基配比为去皮马铃薯100-130克、干酪素4-6克、小麦粉15-24克、琼脂16-20克、蒸馏水1000ml、青霉素3-6ppm，pH6.8-7.0；2)以得到的该株曲霉菌为出发菌株进行下述步骤的诱变筛育(1)将得到的该株曲霉菌用无菌生理盐水制备的孢子菌悬液，其孢子数在106-107个/ml之间，液层的厚度为0.3-0.5cm，进行二次紫外诱变，紫外诱变所用紫外灯功率为15W，照射距离为20cm；第一次紫外诱变的紫外照射时间为5分钟，第二次紫外诱变的紫外照射时间为10分钟，照射后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养2天，挑选30-50个单菌落，用于下一步γ射线诱变；(2)进行γ射线诱变γ射线来源于Co60，待处理菌悬液的孢子数在105-106个/ml，照射剂量为600-800居里；诱变后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养2天，挑选30-50个单菌落，用于下一步的NTG药物诱变剂处理孢子；(3)NTG药物诱变剂处理孢子NTG药物诱变剂的浓度为150-200ppm，待处理菌悬液的孢子数在105-106个/ml，作用时间为20-30分钟，作用温度为30-40℃；诱变后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在28-32℃恒温培养2天，挑选30-50个单菌落；将挑选的该30-50个单菌落，分别做摇瓶试验，并测定其酶活力，选择2-3株产酶最高的菌株；再分别对其做摇瓶试验，并测定其酶活力，选择1株产酶最高的菌株；3)将步骤2)中的步骤(3)得到的1株产酶最高的菌株作为出发菌株，3-5次循环重复进行与上述步骤2)中的(1)-(3)相同的诱变筛育过程，最后得到一株本发明的可高产复合酶的硫色曲霉。
4.权利要求1所述的可高产复合酶的硫色曲霉应用于固态发酵制备饲用复合酶。
全文摘要
本发明涉及的可高产复合酶的硫色曲霉菌为一种可高产复合酶的硫色曲霉菌,孢子呈灰红色,其分类命名为硫色曲霉菌Aspergillus sulphureus,于2001年8月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,其保藏号为CGMCC No.0608;是以辽宁省锦州市太和郊区的大豆耕地土样中筛选分离获得的1株曲霉菌为出发菌株,进行多次诱变选育得到的,可高产木聚糖酶、β—葡聚糖酶和酸性蛋白酶;可用于固态发酵制备饲用复合酶,配制畜禽饲料,能明显提高饲料的利用率,增强畜禽抗病能力,降低养殖物的污染物排放,具有较好的经济效益和积极的环保意义。
文档编号C12Q1/04GK1338511SQ01141789
公开日2002年3月6日 申请日期2001年9月19日 优先权日2001年9月19日
发明者李德发, 范石军, 陆文清, 邢建军, 涂真 申请人:李德发, 范石军, 陆文清, 邢建军, 涂真