专利名称：一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法。
背景技术：
柠檬酸是一种广泛应用子食品、医药、化工等领域的重要有机酸。目前国内柠檬酸的生产供不应求，而且均以玉米、瓜干、糖蜜为原料，产品成本较高。本文的研究以苹果罐头、果汁果茶生产的废料为原料，黑曲霉固态发酵，生产柠檬酸，其工艺筒单、设备投资少而且果渣经发酵后不仅能提取柠檬酸，还可产生大量的果胶酶，可用子果胶酶的提取，二是由于菌体的繁殖，蛋白质含量增加，可做饲料。
影响柠檬酸酸发酵的因素是多方面的，包括碳源、氮源和生长因子、无机盐等，以及相互之间的比例和培养基质中整个营养物质的浓度；产酸刺激物可以促进产酸率的提高；还有一些非营养性因子如pH、温度、通风量等。工艺条件是柠檬酸发酵能否成功的关键因素之一，合适的工艺条件可大大提高柠檬酸发酵水平，其中又以通气、搅拌对发酵影响最为显著。因此有必要对这些因素进行具体详细的研究。近年来，随着国内经济的持续发展，市场对柠檬酸的需求也在增加。我国是柠檬酸生产大国，总产量达20万t/a，其中70%出口国外。因此。采用先进技术改进生产方法，可以降低成本，增加产量，提高产品出口创汇能力。利用固定化细胞连续发酵柠檬酸，是目前研究较多，并初见成效的新技术。本发明以玉米糖液为碳源，对此技术进行了研究。
发明内容
本发明提供了一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法，本发明以黑曲霉为出发菌株，利用PVA复合凝胶包埋黑曲霉的孢子及菌丝体。固定后的细胞经过一系列预培养，用于发酵玉米糖液生产柠檬酸。一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法，其特征在于发酵时，300HiL三角瓶中放入50 mL发酵培养基，加入10 g固定化黑曲霉进行预培养后，在一定温度下，以一定转速的培养。步骤I所述的发酵培养基的制备一定量的玉米糖液8 IOBx (浓度以勃力克斯比重计表示，简写Bx)，加麸皮O. 5 g/100 mL。步骤2所述的玉米粉按δμ/g比例加入耐高温淀粉酶，再加约4倍重量水，95°C温度下，液化30 min，冷却调整至所需浓度备用。步骤I所述的固定化细胞预培养的方法将固定化黑曲霉载体浸泡在糖液浓度3 4 Bx发酵培养基中，摇瓶培养24 h。至孢子开始萌发时，停止培养。将培养基与载体分离，载体待用。步骤4所述的细胞固定化方法将10% (w/v)聚合度1780的聚乙烯醇(PVA)溶液加入l%(w/v)硼砂，3% (w/v)的甘油混合成复合凝胶。复合凝胶冷却到30°C，加入定量的菌丝体及孢子悬浮液，混匀，-40°C成型，制成5. O mmX5.0 mmX5.0 mm的固定化黑曲霉
载体方块备用。步骤I所述的玉米糖液最佳浓度为14 Bx0步骤I所述的最佳发酵温度为36°C。步骤I所述的最佳发酵转速为240 rpm。本发明的有益效果在于本发明以玉米糖液为碳源，对此技术进行了研究。利用固定化细胞连续发酵柠檬酸，是目前研究较多，并初见成效的新技术。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。 本发明所用的菌株为黑曲霉，购买于ACCC，编号为ACCC30333。实施例I
本实施案例说明不同玉米糖液浓度对柠檬酸产量的影响，以不同浓度的玉米糖液为底物(8 16Bx)，pH4. 5-5. 0，温度35°C，250 r/min转速下，发酵64 h，观察玉米糖液浓度对柠檬酸产量的影响。结果如表I所示。由表I可见，在糖液浓度为8-14BX范围内对产酸影响很大，柠檬酸浓度和总酸转化率逐渐增加。而超过14Bx时，产酸变慢，而且总酸转化率开始下降。因此，本实验研究选定最适宜糖度为14 Bx0
表I不同玉米糖液浓度对柠懞酸产量的影响
糖度(Bx) S 10 12 14 1618
发酵吋间(H) 64 64 64 64 6464
柠懞酸(g/L) 72 88 108 132 138143
总酸转化率 95.34 96Λ2 9634 9824 94J793A2实施例2
本实施案例说明不同温度对柠檬酸产量的影响，根据菌种特性介绍，我们观察了温度对柠檬酸产量的影响。调整发酵温度32°C -38°C，实施案例在恒定摇瓶转速250 r/min,初始pH4. 5 5.0，糖度为14 Bx条件下进行。结果如表2所示。由表2可知，温度过高或过低均影响柠檬酸产量及总酸转化率，当温度为36°C时，柠檬酸浓度和总酸转化率最高，分别为136 g/L和98. 26%，因此最佳发酵温度选择为35。。。
_表2不同温度对梓懞酸产量的影响_
温度 CO 30 32 34 36 38 40 柠懞酸 CgL) 128 129 130 136 132 127 总酸转化率 95—74 96—45 96.21 98.26 94—25 93—42实施例3
本实施案例说明不同摇瓶转速对柠檬酸发酵的影响，黑曲霉作为好氧菌其溶氧水平是决定其生产代谢的关键所在。摇瓶阶段，影响溶氧的主要因素便是转速。根据以上条件，我们确定在14 Bx玉米糖液发酵培养基中，加入IOg固定化黑曲霉细胞，控温36°C培养64 h，测定其不同转速下产酸，结果见表3。由表3可知，摇瓶转速对发酵产酸具有极大的影响，是控制柠檬酸发酵最关键的参数之一。在低转速下，显微观察菌球形成缓慢。结合转速与工艺控制的可能，再配合产酸与总酸转化率，选定最适摇瓶转速在240 r/min。
表3不同摇瓶转速对利用黒曲霉进行柠檬酸发酵的影晌
权利要求
1.一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法，其特征在于发酵时，300mL三角瓶中放入50 mL发酵培养基，加入10 g固定化黑曲霉进行预培养后，在一定温度下，以一定转速的培养。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基的制备一定量的玉米糖液8 10Bx，加麸皮 0. 5 g/100 mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，玉米粉按5M/g比例加入耐高温淀粉酶，再加约4倍重量水，95°C温度下，液化30 min，冷却调整至所需浓度备用。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，固定化细胞预培养的方法将固定化黑曲霉载体浸泡在糖液浓度3 4 Bx发酵培养基中，摇瓶培养24 h ;至孢子开始萌发时，停止培养；将培养基与载体分离，载体待用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，细胞固定化方法将10%聚合度1780的聚乙烯醇溶液加入1%硼砂，3%的甘油混合成复合凝胶；复合凝胶冷却到30°C，加入定量的菌丝体及孢子悬浮液，混匀，_40°C成型，制成5.0 mmX5.0 mmX5.0 mm的固定化黑曲霉载体方块。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，玉米糖液浓度为14Bx0
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵温度为36°C。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵转速为240rpm。
全文摘要
本发明提供了一种利用固定化黑曲霉发酵玉米糖液制备柠檬酸的方法，本发明以黑曲霉为出发菌株，利用PVA复合凝胶包埋黑曲霉的孢子及菌丝体。固定后的细胞经过一系列预培养，用于发酵玉米糖液生产柠檬酸。
文档编号C12R1/685GK102851328SQ20121031192
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者金雅新 申请人:太仓市茂通化建有限公司