一种柠檬酸发酵种子罐培养工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及柠檬酸发酵领域，涉及一种柠檬酸发酵种子罐培养工艺。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸（Citric acid)又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷-1,2, 3-三羧酸，分子式 C6H8O7(无水物），为白色颗粒状或白色结晶粉末，相对密度为1. 6550,无臭，具有令人愉快 的强烈的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂，全球范围 内柠檬酸的生产主要通过产柠檬酸的黑曲霉发酵玉米、瓜干、木薯等原料来生产柠檬酸，其 中以玉米作为原料的居多，而发酵过程一般分为种子罐培育过程和发酵罐发酵两部分，其 中尤以前期的种子罐培养更为重要，但是以玉米为原料的柠檬酸发酵种子罐培养过程中， 存在部分孢子发芽较早，料液PH下降，最终抑制其他孢子正常萌发，种子罐中出现菌种极 不均匀的状态，这样会导致种子罐中菌种生长不理想，如果以这样的菌种接入发酵罐，极易 导致发酵生长不稳定，从而导致产能下降严重。
[0003] 现有解决方法一般以优化菌种为主要技术手段，其调整周期长，其菌种的优化需 要多种条件配合，一般在短时间内难以达到很好的想效果。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有柠檬酸发酵种子罐培养遇到的诸多技术瓶颈，提供了一种柠檬酸 发酵种子罐培养工艺，其特点是在柠檬酸发酵种子罐培养中，不同培养阶段控制不同的培 养温度、罐压、通风比、搅拌速率，达到理想的培养效果；本发明根据菌种不同生长阶段的特 性以及生长需要，调控培养温度、罐压、通风比、搅拌速率，以达到最优的培养效果。采用本 发明的工艺后，不仅能提高柠檬酸发酵种子培养效果，提高发酵稳定性，而且能加快发酵生 产强度、提高发酵糖酸转化率和设备利用率，进而提高了企业的经济效益，提升了企业的竞 争力。
[0005] 本发明仅对种子罐培育阶段进行了改进，所采用的具体技术方案如下：其具体步 骤为：
[0006] (1)将玉米液化液打入发酵罐中，添加氮源、饮用水调节N含量与总糖浓度，制备 朽1檬酸发酵种子罐培养基；
[0007] (2)制备黑曲霉孢子悬浮液，按照每毫升种子液中接入70-90万个孢子的比例，通 过血球计数板计数，计算出所需孢子悬浮液的体积，通过火焰圈法将孢子悬浮液接入种子 罐中培养基进行培养，柠檬酸发酵种子罐培养过程按照培养时间分为4个阶段：培养0-12h 阶段；培养12_16h阶段；培养16-24h阶段；培养24h至培养结束；
[0008] 其中培养0-12h阶段，控制培养温度：28-35 °C ;罐压：0.05-0. IOMPa;通风比V/ V · min :0· 05-0. 08 ;搅拌速率：50-60rpm ;
[0009] 培养12_16h阶段，控制培养温度：调节降温系统，通过菌种生长产生的热量 将罐温升温至35-39 °C ;罐压：0. 08-0. IOMPa ;通风比V/V · min :0. 12-0. 14,搅拌速率： 80-100rpm ；
[0010] 培养16-24h阶段，控制培养温度：35-39 °C ;罐压：0. 10-0. 12MPa ;通风比V/ V · min :0· 20-0. 22 ;搅拌速率：80-100rpm ;
[0011] 培养24h至培养结束阶段，控制培养温度：35-39°C ;罐压：0. 10-0. 12MPa ;通风比 V/V · min :0· 26-0. 28 ;搅拌速率：80-100rrpm。
[0012] 其中，之所以控制培养〇_12h阶段的上述参数，主要原因在于其属于孢子萌发阶 段，28-35?即能够有效限制活力旺盛的孢子过快的萌发，又不影响活力较弱的孢子萌发， 从而有效地将此阶段的培养基pH值保持在4. 5以上，当培养基pH值低于4. 5时，就会对孢 子萌发产生强烈的抑制作用故而控制上述温度范围；此外，孢子萌发阶段需氧量比较低，所 以要求的罐压、通风比、搅拌速率都比较低，以维持萌发阶段的需要为主；
[0013] 而在12_16h阶段属于菌丝球形成阶段，此时孢子发芽后逐渐成球，此生长过程产 生热量使得罐温逐渐升高，因此通过控制温度维持在35-39?是菌丝球的最佳生长温度范 围，而由于菌丝球的生长菌体的需氧量也逐渐提高，故而较之上一阶段提高了通风比和搅 拌速率以增加氧气的供给量；
[0014] 培养16_24h阶段属于菌体的快速生长阶段，菌体在此阶段生长代谢旺盛，呼吸作 用加快，其最适生长温度与上一阶段相同均在35-39?范围内，但是由于其营养物质消耗 快，菌体需氧量大，故而在上一阶段的基础上进一步提高了通风比以增加氧气的供给量，但 是此时产酸量较低不能过度提高通风比，防止菌体生长与产酸不能同步增长；
[0015] 培养24h至培养结束阶段属于菌体成熟产酸阶段，菌体在此阶段生长与产酸代谢 旺盛，柠檬酸产量较上一阶段大大提高，菌体的呼吸作用旺盛，营养物质消耗快，菌体需氧 量最大，故而还需要进一步的提高通风比，以保证产酸的需氧量；
[0016] 与现有技术相比，本发明的最主要特征就是对种子罐培养过程进行了细化，并对 细化后的工艺参数进行了重新的调整，较之现有技术有着更好的效果，经过上述细化后发 明人通过对菌体的生长的趋势研宄以及相应产酸量的影响，将细化后的每个培养段工艺参 数进行了培养，更能够适应菌体的需要，较之现有技术中种子罐培养条件一成不变的情况， 可以给菌体提供更好的生长条件，提高了菌体的转化和存活率，且产酸效率大大提高。
[0017] 其中步骤（1)中玉米液化液的总糖浓度为18. 00-24. 00g/100mL ;之后经过添加 氮源、饮用水调节N含量与总糖浓度后所获得的柠檬酸发酵种子罐培养基中总糖浓度为 8.00-12. 00g/100mL。
[0018] 上述技术方案中，由于无机氮源可以被菌体快速吸收利用，而且价格相对便宜，所 以本发明氮源采用硫酸铵或尿素或碳铵，N源的加入量为培养基总质量的0. 04-0. 08%，总 糖为8. 00-12. 00g/100mL，如果总糖过低，则培养基不能为菌种生长提供足够的C源；如果 总糖过高，则抑制孢子萌发和菌体生长。
[0019] 步骤（2)中柠檬酸发酵种子罐总培养时间在25-32h。
[0020] 步骤（2)中培养基菌球浓度大于400000个/ml ;这是由于在现有培养条件下黑曲 霉孢子的萌发率在60%左右，而为了达到最佳的培养效果，必须保证菌球浓度在400000个 /ml以上，而为了保证这一菌球浓度，则在接入时必须控制接入量一般为每毫升种子液中接 入70-90万个孢子。
[0021] 上述的方法主要针对的是以黑曲霉为生产菌株的工艺，其中优选采用黑曲霉 C〇-827等，其接入量一般为每_升种子液中接入70-90万个孢子。
[0022] 经过上述改进工艺获得的种子罐菌种可以直接应用与后步的发酵工艺中，例如将 过滤玉米液化清液和玉米液化液混合制备发酵培养基，打入发酵罐中消毒后，移入种子罐 培养合格的菌种开始柠檬酸发酵，种子液体积占总发酵液体积的12 %，控制发酵控制参数 在合理范围内至发酵终了。但是上述步骤均可以采用现有技术完成，发明人在此不再赘述。
[0023] 综上所述，本发明的发明人对种子罐培养过程进行了细化，并对细化后的工艺参 数，特别是培养温度、罐压、通风比、搅拌速率分段控制，有效地缩短了不同孢子之间萌发速 率的差距，保证在种子培养的每个阶段有合适的PH值、温度与溶氧，有效地缩小了菌种之 间的差异，增强了柠檬酸发酵种子罐培养的稳定性，从而保证柠檬酸发酵持续稳定高效进 行，提高糖酸转化率与发酵效率率，从而降低发酵成本。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例来进一步说明本发明，可以使本领域技术人员更全面的理解本发 明，但不以任何方式限制本发明，其中发酵罐发酵时过滤玉米液化清液与玉米液化液混合 比例等参数均采用现有常规柠檬酸发酵过程中的参数，其他未标明的发酵罐发酵阶段的参 数也均参考现有技术。下述实施例中所采用的黑曲霉均为黑曲霉Co-827。
[0025] 实施例1
[0026] 一种柠檬酸发酵种子罐培养工艺，其具体步骤为：
[0027] (1)将总糖为20. 50g/100mL玉米液化液打入种子罐中，同时添加饮用水和占 培养基总质量〇. 04%的N源，升温至121°C消毒30分钟，降温至29. 5°C后，检测总糖为 8. 50g/100mL ;制备黑曲霉孢子悬浮液，按照每毫升种子液中接入79万个孢子的比例，通过 血球计数板计数，计算出所需孢子悬浮液的体积，通过火焰圈法将孢子悬浮液接入种子罐 中培养基进行培养；
[0028] (2)柠檬酸发酵种子罐培养的0-12h阶段，控制培养温度：29. 5-33. 5°C ;罐压： 0· 06-0. 08MPa ;通风比：0· 06-0. 07(V/V · min);搅拌速率：55-57rpm。
[0029] (3)柠檬酸发酵种子罐培养的12_16h阶段，控制培养温度：调节降温系统，通过 菌种生长产生的热量将罐温升温至35. 5°C ;罐压：0. 08-0. 09MPa ;通风比：0. 12-0. 13(V/ V · min)，揽拌速率：80_90rpm ;
[0030] (4)柠檬酸发酵种子罐培养的16-24h阶段，控制培养温度：36. 0-38. 5°C ;罐压： 0· 11-0. 12MPa ;通风比：0· 21-0. 22(V/V · min);搅拌速率：85-95rpm。
[0031] (5)柠檬酸发酵种子罐培养的24-29h阶段，控制培养温度：35. 0-39. (TC ;罐压： 0· 10-0. 12MPa ;通风比：0· 27-0. 28(V/V · min);搅拌速率：90-100rpm。
[0032] (6)将过滤玉米液化清液与玉米液化液混合后打入发酵罐中，开启搅拌使培养基 混合均匀，升温至90°C消毒30分钟，然后降温至35. 8°C ;
[0033] (7)将培养好的种子液移入发酵罐中，开始发酵，种子液体积占总发酵液体积的 12%，发酵液中菌球浓度达到46000个/mL，通风发酵至发酵终了；
[0034] 在此条件下，发酵55h，产酸18. 93%，转化率101. 12%，发酵指数为3. 44g/L · h。
[0035] 实施例2
[0036] 一种柠檬酸发酵种子罐培养工艺，其具体步骤为：
[0037] (1)将总糖为23. 50g/100mL玉米液化液打入种子罐中，同时添加饮用水和占 培养基总质量0. 07%的N源，升温至121°C消毒30分钟，降温至28. 5°C后，检测总糖为 11. 80g/100mL ;制备黑曲霉孢子悬浮液，按照每毫升种子液中接入83万个孢子的比例，通 过血球计数板计数，计算出所需孢子悬浮液的体积，通过火焰圈法将孢子悬浮液接入种子 罐中培养基进行培养；
[0038] (2)柠檬酸发酵种子罐培养的0-12h阶段，控制培养温度：28. 5-34. 5°C ;罐压： 0· 06-0. 095MPa ;通风比：0· 07-0. 08 (V/V · min);搅拌速率：53-55rpm ;
[0039] (3)柠檬酸发酵种子罐培养的12_16h阶段，控制培养温度：调节降温系统，通过 菌种生长产生的热量将罐温升温至35. 8°C ;罐压：0. 08-0. 09MPa ;通风比：0. 13-0. 14(V/ V · min)，搅拌速率：82_92rpm ;
[0040] (4)柠檬酸发酵种子罐培养的16-24h阶段，控制培养温度：35. 8-38. 5°C ;罐压： 0· 10-0. 12MPa ;通风比：0· 21-0. 22(V/V · min);搅拌速率：85-95rpm ;
[0041] (5)柠檬酸发酵种子罐培养的24-30h阶段，控制培养温度：36. 0-39. (TC ;罐压： 0· 11-0. 12MPa ;通风比：0· 27-0. 28(V/V · min);搅拌速率：85-95rpm ;
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