一种混菌发酵农作物秸秆生产柠檬酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种混菌发酵农作物秸秆生产柠檬酸的方法，1）原材料处理：取当年的农作物秸秆，洗净，粉碎，过160?180目水筛，在100W功率超声处理15min，制得农作物秸秆粉；取豆粕粉碎，过80目水筛，制得豆粕粉；2）发酵培养基的配制和灭菌：3）接种发酵，该发酵过程由A、B和C三阶段组成，接种发酵周期为112h；4）柠檬酸提取。本发明优点在于：以纤代粮，利用水稻秸秆发酵生产柠檬酸，节约粮食，降低成本，提高产品附加值；混菌同步糖化发酵技术，缩短发酵周期，减少生产设备投资，提高生产效率。
【专利说明】
一种混菌发酵农作物秸秆生产柠檬酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种混菌发酵农作物秸杆生产柠檬酸的方法，属于生物发酵生产有机酸技术领域。
【背景技术】
[0002]柠檬酸是目前世界上年生产量和消费量最大的有机酸，主要采用发酵法生产。发酵法的原料主要分为糖质原料、淀粉类原料和石油类原料。国外柠檬酸发酵主要采用糖蜜作为原料，我国主要采用淀粉质原料，20世纪九十年代，随着我国柠檬酸工业的飞速发展，开启了我国玉米等谷物原料发酵的新时代，目前是我国生产柠檬酸的主流。而石油类原料银成本和安全想问题没有坚持研究和生产。但柠檬酸发酵的粮耗一直徘徊在1.7?1.9t/t，所以我国柠檬酸发酵每年要消耗大量的粮食。出现了发酵生产和人畜争粮的现象。本发明采用农作物的秸杆为原料发酵生产柠檬酸，同时采用混菌进行发酵，极大的降低了发酵生产的成本。农作物的秸杆来源广泛、获取容易、价格低廉，并且糖化发酵都采用微生物方法，极大降低了发酵生产成本。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服了发酵生产原料成本过高及与人畜争粮的不足，提供了一种新的发酵工艺。
[0004]本发明是通过如下技术方案实现的:一种混菌发酵农作物秸杆生产柠檬酸的方法，按如下步骤进行:
步骤I)原材料处理:取当年的农作物秸杆，洗净，粉碎，过160-180目水筛，在10W功率超声处理15min，制得农作物秸杆粉；
取豆柏粉碎，过80目水筛，制得豆柏粉；
步骤2)发酵培养基的配制和灭菌:所述的发酵培养基各原料及用量为:固形物120g;(NH4)2SO4，4.8g;KH2PO4，3.6g;维生素bl，0.6g; Tween80，5.4g;微量元素混合液120ml ；将发酵培养基加水至1000ml，PH调节至4.5，制得发酵培养液；向20L机械通风发酵罐投料12L发酵培养液，在121°C下灭菌25min，制得培养基料；
所述的固形物是指农作物秸杆粉和豆柏粉按重量比4:1的混合物；
所述的微量元素混合液g/L:氨基乙酸，0.5g/L;MgS04.7H20,3.0g/L；FeS04.7H20,0.1g/L；CoS04,0.1g/L；CaCl2.2H20,0.lg/L；ZnSO4.7H20,0.19g/L；CuSO4.5H20,0.01g/L；AlK(SO4)2.12H20,0.01g/L；H3BO3,0.01g/L；Na2MoO4.2H20,0.01g/L；MnS04.H20,0.01g/L；步骤3)接种发酵:该发酵过程由A、B和C三阶段组成，其中:
A阶段、当培养基料温度降到40 °C时，加入菌龄16h的黄孢原毛平革菌(PAaflerocAaeiecAixsoSjPori?)—级菌种，其接种量为13%，开动搅拌，转速280r/min，通气量为0.8VVM，发酵温度设定32°C，调节发酵过程的PH为4.5，发酵12h;
B阶段、A阶段发酵进行12h后，加入种龄12h的里氏木霉(Trichoderma reesei)—级菌种，其接种量为10%，把搅拌转速调为320r/min，通气量为0.8VVM，发酵温度调节为30 V，维持发酵过程的PH为4.5，发酵24小时；
C阶段、13阶段发酵进行24h后，加入种龄15h的黑曲霉(yispergiHus fiiger)—级菌种，其接种量为12%，加入2%的甲醇，搅拌转速调为240r/min，通气量0.9 VVM，发酵温度设定为280C，在该阶段发酵过程中需添加聚醚类的消泡剂；
所述消泡剂添加的方法:在培养基料中一次性添加质量分数为0.1-0.3%。的消泡剂，然后在发酵周期再进行流加或滴加，使用的质量分数为0.3-0.5%0;
上述A、B和C三个阶段的发酵周期共为112h;
步骤4)柠檬酸提取:采用色谱分离技术提取柠檬酸。
[0005]所述的农作物秸杆为水稻秸杆。
[0006]本发明的有益效果:
(1)以纤代粮，利用水稻秸杆发酵生产柠檬酸，节约粮食，降低成本，提高产品附加值；
(2)混菌(里氏木霉、黄孢原毛平革菌和黑曲霉)同步糖化发酵技术，缩短发酵周期，减少生产设备投资，提高生产效率。
【具体实施方式】
[0007]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0008]实施例1
本实施例中接种发酵所用的菌种，均来源于市场购买，具体信息如下:
(I)黄抱原毛平革菌{Phanerochaete chrysosporiurn)
平台资源号:1511C0005000004799;
菌株保藏编号:CICC40719;
中文名称:黄孢原毛平革菌；
属名:Phanerochaete ；
种名加词:chrysosporium；
来源:天津市工业微生物研究所；
收藏时间:2006.11.10。(2)里氏木霉(r_ricAoc/e_raa reesei)
平台资源号:1511C0005000003012;
菌株保藏编号:CICC40359 ；
中文名称:里氏木霉；
属名:Trichoderma ；
种名加词:reesei ；
来源:上海市工业微生物研究所(M306);
收藏时间:2005.11.25。(3)黑曲霉(dus niger)
平台资源号:1511C0005000008244;
菌株保藏编号:CICC41275;
中文名称:黑曲霉；
属名:Aspergi I Ius ；
种名加词:niger; 来源:黑龙江轻工科学研究院(L242);
收藏时间:2008.4.15。一级菌种的制备
(I)黄抱原毛平革菌{Phanerochaete chrysosporium)一级菌种黄孢原毛平革菌一级菌种的制备:500ml三角瓶中，一级种子培养基装量200ml，黄孢原毛平革菌孢子悬浮液的接种量为8%，在30°(:，24(^/1^11摇床培养，至菌种浓度约为7乂106CFU/ml;
所述的一级种子培养基:稻草秸杆粉(过180目筛)100g/L;豆柏粉(过80目筛)20g/L;葡萄糖 12g/L；KH2PO4 ,3.6g/L； (NH4)2SO4 ,0.lg/L；VBi,0.05g/L；MgS04.7H20,2.5g/L； jjp蒸馈水至1000ml，？11值自然。
[0009]所述的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液的制备:将黄孢原毛平革菌接种到斜面培养基置于28°C恒温箱中培养，5?7d开始形成孢子，向试管中加入无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子从斜面刮下，用6层纱布过滤，去除菌丝片段，制成2X 17个/ml的悬浮液，备用；
所述的斜面培养基为:土豆浸出液200g;葡萄糖20g;琼脂20g; KH2PO4，3.2g、MgS〇4，1.8g;加水 1000ml，PH 自然。
[0010](2)里氏木霉(r_ricAot/er?a reesei)一级菌种
里氏木霉一级菌种的制备:500ml三角瓶中，一级种子培养基装量200ml，里氏木霉孢子悬浮液的接种量为10%，28-30°(:全温摇瓶柜中，22(^/1^11培养，至菌种浓度约为6 X 16CFU/ml ；
所述的一级种子培养基:稻草秸杆粉(过180目筛)100g/L、豆柏粉(过80目筛)20g/L、葡萄糖 12g/L、(NH4)2S04 2.2g/L、MgSO4.7H20 0.5g/L、KH2P04 4.2g/L、CaCl2.2H200.4g/L ， PH为4.5。
[0011]所述的里氏木霉孢子悬浮液的制备:将里氏木霉接种到PDA培养基并斜面置于25°C恒温箱中培养，培养6d，产生大量孢子，向试管中加入无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子从斜面刮下，用6层纱布过滤，去除菌丝片段，制成2 X 17个/ml的里氏木霉孢子悬浮液，备用。
[0012](3)黑曲霉niger)一级菌种
黑曲霉(dSjOe1-g'iDus—级菌种的制备:1000ml三角瓶中加入250ml的摇瓶培养基，纱布封口，灭菌，待温度下降至40°C以下时，接入上述黑曲霉孢子悬液100ml，35°C恒温摇瓶柜中，280r/min，培养至黑曲霉菌丝球浓度约为80万个/ml。合格的菌丝球致密、直径不超过0.1mm，菌丝短、粗，分枝少，部分膨胀；
所述的摇瓶培养基:稻草秸杆粉(过180目筛)30g/L、葡萄糖20g/L、豆柏粉(过80目筛)20g/L^(NH4)2SO4 3.2g/L、NH4N03，2.6g/L ^KH2PO4，2.4g/L、PH 4.5。
[0013]所述的黑曲霉孢子悬浮液的制备:1000ml三角瓶中装入25g麸皮，15g稻草粉，(NH4)2SO4，0.6g;加水50ml，拌匀、121°C灭菌lh;(35±l)°C培养，开始时每天早晚各翻动一次，以降低品温，3d后静置培养，5-7d制成麸曲种;每瓶加入无菌生理盐水用六层纱布过滤，制成2.5 X 17个/ml的孢子悬液备用。
[0014]实施例2
本实施例所采用的农作物秸杆为水稻秸杆。
[0015]—种混菌发酵农作物秸杆生产柠檬酸的方法，按如下步骤进行: 步骤I)原材料处理:取当年的农作物秸杆，洗净，粉碎，过160-180目水筛，在10W功率超声处理15min，制得农作物秸杆粉；
取豆柏粉碎，过80目水筛，制得豆柏粉。
[0016]步骤2)发酵培养基的配制和灭菌:所述的发酵培养基各原料及用量为:固形物120g ； (NH4)2SO4，4.8g;KH2PO4，3.6g;维生素bl，0.6g; Tween80，5.4g;微量元素混合液120ml；
将发酵培养基加水至1000ml，PH调节至4.5，制得发酵培养液；向20L机械通风发酵罐投料12L发酵培养液，在121°C下灭菌25min，制得培养基料；
所述的固形物是指农作物秸杆粉和豆柏粉按重量比4:1的混合物；
所述的微量元素混合液g/L:氨基乙酸，0.5g/L;MgS04.7H20，3.0g/L;FeS04.7H20，0.1g/L;CoS04，0.1g/L;CaCl2.2H20,0.lg/L；ZnSO4.7H20,0.19g/L；CuSO4.5H20,0.01g/L；AlK(SO4)2.12H20,0.01g/L；H3BO3,0.01g/L；Na2MoO4.2H20,0.01g/L；MnS04.H20，0.01g/L。
[0017]步骤3)接种发酵:该发酵过程由A、B和C三阶段组成，其中:
A阶段、当培养基料温度降到40 °C时，加入菌龄16h的黄孢原毛平革菌(PAaflerocAaeiecAixsoSjPori?)—级菌种，其接种量为13%，开动搅拌，转速280r/min，通气量为0.8VVM，发酵温度设定32°C，调节发酵过程的PH为4.5，发酵12h;
B阶段、A阶段发酵进行12h后，加入种龄12h的里氏木霉(Trichoderma reesei)—级菌种，其接种量为10%，把搅拌转速调为320r/min，通气量为0.8VVM，发酵温度调节为30°C，维持发酵过程的PH为4.5，发酵24小时；
C阶段、13阶段发酵进行24h后，加入种龄15h的黑曲霉(yispergiHus fiiger)—级菌种，其接种量为12%，加入2%的甲醇，搅拌转速调为240r/min，通气量0.9 VVM，发酵温度设定为280C，在该阶段发酵过程中需添加聚醚类的消泡剂；
所述消泡剂添加的方法:在培养基料中一次性添加质量分数为0.1-0.3%。的消泡剂，然后在发酵周期再进行流加或滴加，使用的质量分数为0.3-0.5%0;
上述A、B和C三个阶段的发酵周期共为112h。
[0018]步骤4)柠檬酸提取:采用色谱分离技术提取柠檬酸，经检测柠檬酸可达108.6g/L。
【主权项】
1.一种混菌发酵农作物秸杆生产柠檬酸的方法，其特征在于:按如下步骤进行: 步骤I)原材料处理:取当年的农作物秸杆，洗净，粉碎，过160-180目水筛，在10W功率超声处理15min，制得农作物秸杆粉； 取豆柏粉碎，过80目水筛，制得豆柏粉； 步骤2)发酵培养基的配制和灭菌:所述的发酵培养基各原料及用量为:固形物120g;(NH4)2SO4，4.8g; KH2PO4，3.6g;维生素bl，0.6g; Tween80，5.4g;微量元素混合液120ml ；将发酵培养基加水至1000ml，PH调节至4.5，制得发酵培养液；向20L机械通风发酵罐投料12L发酵培养液，在121°C下灭菌25min，制得培养基料； 所述的固形物是指农作物秸杆粉和豆柏粉按重量比4:1的混合物； 所述的微量元素混合液g/L:氨基乙酸，0.5g/L;MgS04.7H20，3.0g/L;FeS04.7H20，0.1g/L;CoS04，0.1g/L;CaCl2.2H20,0.lg/L；ZnSO4.7H20,0.19g/L；CuSO4.5H20,0.01g/L；AlK(SO4)2.12H20,0.01g/L；H3BO3,0.01g/L；Na2MoO4.2H20,0.01g/L；MnS04.H20,0.01g/L；步骤3)接种发酵:该发酵过程由A、B和C三阶段组成，其中: A阶段、当培养基料温度降到40 °C时，加入菌龄16h的黄孢原毛平革菌(PAaflerocAaeiecAixsoSjPori?)—级菌种，其接种量为13%，开动搅拌，转速280r/min，通气量为0.8VVM，发酵温度设定32°C，调节发酵过程的PH为4.5，发酵12h; B阶段、A阶段发酵进行12h后，加入种龄12h的里氏木霉(7>icAoc/er?a reesei)—级菌种，其接种量为10%，把搅拌转速调为320r/min，通气量为0.8VVM，发酵温度调节为30°C，维持发酵过程的PH为4.5，发酵24小时； C阶段、13阶段发酵进行24h后，加入种龄15h的黑曲霉(yispergiHus fiiger)—级菌种，其接种量为12%，加入2%的甲醇，搅拌转速调为240r/min，通气量0.9 VVM，发酵温度设定为280C，在该阶段发酵过程中需添加聚醚类的消泡剂； 所述消泡剂添加的方法:在培养基料中一次性添加质量分数为0.1-0.3%。的消泡剂，然后在发酵周期再进行流加或滴加，使用的质量分数为0.3-0.5%0; 上述A、B和C三个阶段的发酵周期共为112h; 步骤4)柠檬酸提取:采用色谱分离技术提取柠檬酸。2.根据权利要求1所述的一种混菌发酵农作物秸杆生产柠檬酸的方法，其特征在于:所述的农作物秸杆为水稻秸杆。
【文档编号】C12R1/685GK105886556SQ201610413776
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】孙科, 王 锋, 宋凯, 曹梦竺
【申请人】徐州生物工程职业技术学院