专利名称：一种柠檬酸发酵清液的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种柠檬酸发酵清液的分析方法。
背景技术：
国内柠檬酸生产是以玉米等淀粉类物质为原料，在α -淀粉酶的作用下，使淀粉链中的α-1，4糖苷键被水解。支链淀粉的最终产物为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和α-极限糊精；直链淀粉的最终产物为葡萄糖、少量麦芽糖和麦芽三糖。糖的检测是控制柠檬酸生产过程的最常见的指标。目前，柠檬酸生产大多以费林法检测柠檬酸发酵液中的残糖，所述费林法检测柠檬酸发酵液中的残糖主要原理是低聚糖在盐酸或酶的作用下，发生水解反应，生成具有还原性的单糖，所述单糖再用菲林试剂进行滴定，以次甲基蓝作为指示剂来检测糖的含量，但是该方法只能检测出残糖总量，而无法分析出各种糖的具体组分及其含量。 此外，采用离子交换色谱对柠檬酸发酵清液进行分析，柠檬酸的特征峰出现在单糖和寡糖中间，因此，会影响检测结果的准确性，也无法有效分离柠檬酸与糖。
发明内容
本发明的目的为了克服采用现有技术对柠檬酸发酵清液中的糖进行检测，只能检测出残糖总量，而无法检测出柠檬酸发酵清液中的糖的具体种类并无法准确定量各种糖的含量的缺陷，提供一种能够检测出柠檬酸发酵清液中的糖的具体种类并能够进行准确定量各种糖的含量的柠檬酸发酵清液的分析方法。本发明提供了一种柠檬酸发酵清液的分析方法，所述柠檬酸发酵清液含有柠檬酸和糖，所述糖含有单糖和/或寡糖，其中，所述方法包括使用色谱柱，所述色谱柱包括串联的反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱；在色谱分离条件下，将所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液从反相色谱分离柱的上端引入，依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触，并连续用淋洗剂洗脱所述反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱，将流出液A从离子排斥色谱柱的下端引出，所述流动相的组成和色谱分离的条件使得糖中的各组分以及柠檬酸先后被分离出来，并经色谱分析后得到保留时间和积峰面积，通过与同等条件下得到的标准谱图对比得到柠檬酸发酵清液中糖的组成和糖中的各组分含量以及发酵清液中柠檬酸的含量；所述淋洗剂和流动相的组成相同。本发明的发明人经过深入地研究发现，采用本发明提供的方法对所述柠檬酸发酵清液进行分析，将所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液依次通过由反相色谱柱和离子排斥色谱柱的串联组成的色谱分离柱，可实现对所述柠檬酸发酵清液中的糖中的各组分以及柠檬酸发酵清液中的柠檬酸的有效分离，并经过色谱分析后，与同等条件下得到的标准谱图进行对比，从峰的位置和面积可进一步判断出柠檬酸发酵清液中的糖的各组分以及柠檬酸发酵清液中的柠檬酸的含量，为柠檬酸发酵工艺的参数调整提供数据参考，进而可以从根本上降低发酵液中残糖的含量，提高柠檬酸的产率。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
图1为根据实施例1的方法得到的标准色谱图； 图2为根据实施例2的方法得到的标准色谱图； 图3为根据实施例3的方法得到的标准色谱图； 图4为根据实施例4的方法得到的标准色谱图。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。根据本发明提供的柠檬酸发酵清液的分析方法，所述柠檬酸发酵清液含有柠檬酸和糖，所述糖含有单糖和/或寡糖，其中，所述方法包括使用色谱柱，所述色谱柱包括串联的反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱；在色谱分离条件下，将所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液从反相色谱分离柱的上端引入，依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触，并连续用淋洗剂洗脱所述反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱，将流出液A从离子排斥色谱柱的下端引出，所述流动相的组成和色谱分离的条件使得糖中的各组分以及柠檬酸先后被分离出来，并经色谱分析后得到保留时间和积峰面积，通过与同等条件下得到的标准谱图对比得到柠檬酸发酵清液中糖的组成和糖中的各组分含量以及发酵清液中柠檬酸的含量；所述淋洗剂和流动相的组成相同。需要说明的是，根据本发明的方法对柠檬酸发酵液中的各组分进行分析，在将柠檬酸发酵清液进行色谱分离之前或之后，测定标准曲线，与以采用本发明的方法得到的色谱图进行对比，所述测定标准曲线的方法为在相应的色谱分离条件下，将已知配比的柠檬酸、葡萄糖、果糖、麦芽二糖和麦芽三糖的混合溶液用上述色谱柱进行色谱分离，得到各物质的保留时间和峰面积的标准曲线。在该条件下得到的色谱图与所述标准色谱图进行对比便可得知未知组成的柠檬酸发酵清液中的糖的组成和糖中各组分含量以及发酵清液中柠檬酸的含量。根据本发明，所述柠檬酸发酵清液指在柠檬酸发酵过程中或发酵完毕后所得到去除了柠檬酸酸发酵液中的颗粒杂质和沉淀物后(例如菌体、蛋白等)所得的溶液。所述柠檬酸发酵液可以通过本领域常规的柠檬酸发酵方法制得，如黑曲霉发酵的方法例如，将淀粉质原料(如玉米等)粉碎并与淀粉酶混合进行酶解，以酶解产物配置发酵培养基，并向发酵培养基中接入黑曲霉菌种，发酵后得到柠檬酸发酵液。其中，所述除去柠檬酸酸发酵液中的颗粒杂质和沉淀物的方法可以为现有的各种方法，例如，离心分离、过滤等。通常来说， 在柠檬酸的生产过程中，所得的柠檬酸发酵清液中含有糖，所述糖含有单糖和/或寡糖，例如，所述单糖通常可以选自葡萄糖和果糖中的一种或多种；所述寡糖通常可以选自麦芽二糖和麦芽三糖中的一种或多种。根据本发明，所述反相色谱是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。目前，反相色谱的固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分与疏水基团之间疏水作用的不同而分离。离子排斥色谱分离是建立在Dormon膜排斥效应的基础上，空间排阻和吸附作用共同作用的机理，进行各组分分离的。根据上述反相色谱和离子排斥色谱的分离原理，可以推测，本发明利用串联的反相色谱柱和离子排斥色谱柱将柠檬酸发酵清液中的柠檬酸和各种糖相分离的机理可能是 柠檬酸和糖类具有不同的疏水性能，通过反相色谱柱可以将柠檬酸和糖分离；而糖中的各组分的空间排阻作用不同，可在离子排斥色谱柱中得到进一步分离。本发明中，用流动相将柠檬酸发酵液稀释可以减少得到的色谱图中倒峰的干扰， 减少基线的毛刺。所述柠檬酸发酵清液与流动相的体积比可以在很大范围内变动，但为了实现更为有效地分离，优选情况下，所述柠檬酸发酵清液与流动相的体积比为1 5-20，进一步优选为1 5-15。根据本发明，本发明对流动相的种类没有特别地限制，只要能实现将柠檬酸发酵清液中的各组分分离即可。本发明的发明人发现，当所述流动相为有机溶剂和缓冲液的混合液时，色谱分离的效果非常好。所述流动相的含量可以在很大范围内变动，通常来说，以所述流动相的总体积为基准，所述有机溶剂的含量为1-10体积％ ；所述缓冲液的含量为 90-99 体积 ％。根据本发明，所述有机溶剂和缓冲液可以为现有的各种能用于色谱分离并且能将柠檬酸发酵清液中各组分分离的有机溶剂和缓冲液，通常情况下，所述有机溶剂选自乙腈、 乙醇和异丙醇中的一种或多种；所述缓冲液选自硫酸溶液、盐酸溶液，磷酸溶液中的一种或多种。根据本发明，为实现柠檬酸发酵清液中的糖中的各组分以及柠檬酸发酵清液中的柠檬酸的有效分离，优选情况下，所述缓冲液的浓度为0. 001-0. 02mol/L,进一步优选为 0. 004-0. 008mol/L。且本发明对所述缓冲液的pH没有特别地限制，但为了进一步提高分离的效果，优选地，所述缓冲液的PH值为1.5-3。根据本发明，所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液的用量可以根据反相色谱柱和离子排斥色谱柱中的填料的体积来选择。所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液与所述反相色谱柱中填料的体积比可以在很大的范围内变动，例如可以为1 130-4000，优选为 1 200-400;所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液与离子排斥色谱柱中填料的体积比也可以在很大范围内变动，例如可以为1 400-14000，优选为1 700-1400。根据本发明，为了保证所述柠檬酸发酵清液中的各组分能够得到很好地分离，所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液从反相色谱分离柱的上端引入应该在很短的时间内完成，因此，引入时间可以忽略不计。根据本发明，虽然所述淋洗剂的流速可以在较大范围内变动，但是为了提高分离效果并节约时间，优选情况下，所述淋洗剂的流速为0. l-1.5mL/min，进一步优选为 0.4-0. 7mL/min。本发明对色谱分离的温度没有特别地限制，但为了确保流动相的粘度小，减少液相色谱系统压力。具体地，所述色谱分离的温度可以为20-80°C，本发明更优选在40-60°C 下进行。根据本发明，所述反相色谱柱的填料以及所述离子排斥色谱柱的填料可以为本领域技术人员公知的各种用于填装反相色谱柱和离子排斥色谱柱的填料并可以通过商购得到，只要能够达到吸附解析所述柠檬酸发酵清液中的柠檬酸和糖，并将柠檬酸发酵清液中的糖中的各组分以及柠檬酸先后分离出来即可，例如，所述反相色谱柱的填料以二氧化硅为基体，在二氧化硅表面键合的官能团选自C4烷基、C8烷基和C18烷基中的一种；例如，所斥色谱柱的填料可以为聚苯乙烯与二乙烯基苯共聚物，交换基团为-SO3H。下面将通过具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。在下述实施例和对比例中，采用高效液相色谱仪对所述柠檬酸发酵清液中各组分进行组分和含量的分析，所述高效液相色谱仪是购于Waters公司的高效液相色谱仪，其中，该高效液相色谱仪中的色谱柱为串联的反相色谱分离柱(型号=Diamonsil C18，购于杭州库仑科技有限公司，填料以二氧化硅为基体、官能团为C18烷基，4. 6X 150mm)和离子排斥色谱柱(型号=Aminex HPX-87H，购于天津谱祥科技有限公司，填料是聚苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物，交换基团为-SO3H, 7. 8 X 300mm)。以下实施例中所用柠檬酸发酵液可以通过以下方法制得将0. 872千克玉米用 SFSP系列锤片式粉碎机进行粉碎，得到平均颗粒直径为2毫米(采用美国PPS公司的Accu Sizer TM 780光学粒径检测仪测定)的0. 871千克粉碎产物；一次液化温度83 士 1°C，二次液化控制温度93士 1°C，将粉碎产物与淀粉酶混合进行喷射液化，维持时间为50分钟，所述酶解的PH值维持在5. 7-6. 2 ；加入活力彡2000u/ml的α -淀粉酶0. 7g/kg玉米粉(购自诺维信公司)；温度降至38°C，接种生物量为18g/L (母液)的黑曲霉，所得混合物在37°C 下于发酵罐中搅拌培养，得到柠檬酸发酵液。实施例1本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵清液的分析方法。(1)柠檬酸发酵清液的制备按上述方法搅拌培养20小时后得到的柠檬酸浓度为
4.21重量％的柠檬酸发酵液，取50mL该柠檬酸发酵液，在室温(25°C )、转速为4000rpm的条件下离心分离5min，得到上清液，即柠檬酸发酵清液。(2)色谱分析将步骤(1)所得的IOmL柠檬酸发酵清液用流动相稀释10倍(所述流动相为硫酸水溶液(浓度为0. 005mol · L-1，pH为2. 15)与乙腈按体积比为98. 5:1.5 混合)得到混合液。在60°C下，并在淋洗剂以0.6mL/min的流速的带动下，将20uL该混合液通入所述高效液相色谱仪中，使其依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触。由于柠檬酸发酵清液中各组分在色谱柱中滞留的时间不同，从而先后从色谱柱中流出，再经过检测器，由记录仪记录色谱图。在同等条件下，将1. Og的柠檬酸、0. Sg的葡萄糖、0. Sg的果糖、0. 4g的麦芽二糖和0. 4g的麦芽三糖与IOOmL流动相混合，取20uL该混合液通过上述方法进行色谱分离，得到标准色谱图，如图1所示。通过与标准谱图对比，可得知所述柠檬酸清液中的组分以及各组分的含量，所得结果如下保留时间为15. 979min的是葡萄糖，含量为6. 91重量％ ；保留时间为17. 043min 的是果糖，含量为0. 02重量％ ；保留时间为14. 55min的是麦芽二糖，含量为1. 78重量％ ； 保留时间为13. 256min的是麦芽三糖，含量为0. 82重量％ ；保留时间为20. 433min的是柠檬酸，含量为4. 21重量％。从图1的结果可以说明，在此条件下柠檬酸发酵液中残糖的组分与柠檬酸能够得到有效分离。实施例2本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵清液的分析方法。(1)柠檬酸发酵清液的制备按上述方法搅拌培养30小时后得到的柠檬酸浓度为
5.26重量％的柠檬酸发酵液，取50mL该柠檬酸发酵液，在室温(25 °C )、转速为4000rpm的条件下离心分离5min，得到上清液，即柠檬酸发酵清液
(2)色谱分析将步骤(1)所得的柠檬酸发酵清液用流动相稀释5倍(所述流动相为硫酸水溶液(浓度为0. 005mol · L-1，ρΗ为2. 15)与乙腈按体积比为96. 5 3. 5混合) 得到混合液。在60°C下，并在淋洗剂以0.6mL/min的流速的带动下，将20uL该混合液通入所述高效液相色谱仪中，使其依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触。由于柠檬酸发酵清液中各组分在固定相中滞留的时间不同，从而先后从固定相中流出，再经过检测器， 由记录仪记录色谱图。在同等条件下，将0. 5g的柠檬酸、0. 4g的葡萄糖、0. 4g的果糖、0. 2g 的麦芽二糖和0. 2g的麦芽三糖与IOOmL流动相混合，取20uL该混合液通过上述方法进行色谱分离，得到标准色谱图，如图2所示。通过与标准谱图对比便可得知所述柠檬酸清液中的组分以及各组分的含量，所得结果如下保留时间为15.7(Mmin的色谱图为葡萄糖，含量为5.4重量％ ；保留时间为 16. 717min的是果糖，含量为0.01重量％ ；保留时间为14. 048min的是麦芽二糖，含量为1.30重量％ ；保留时间为13. 359min的是麦芽三糖，含量为0. 42重量％ ；保留时间为 18. 088min的是柠檬酸，含量为5.沈重量％。从图2的结果可以说明，在此条件下柠檬酸发酵液中残糖的组分与柠檬酸能够得到有效分离测定。实施例3本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵清液的分析方法。(1)柠檬酸发酵清液的制备按上述方法搅拌培养40小时后得到的柠檬酸浓度为 10.21重量％的柠檬酸发酵液，取50mL该柠檬酸发酵液，在室温(25 °C )、转速为4000rpm的条件下离心分离5min，得到上清液，即柠檬酸发酵清液。(2)色谱分析将步骤(1)所得的柠檬酸发酵清液用流动相稀释10倍(所述流动相为硫酸水溶液(浓度为0. 005mol · L-l,pH为2. 15)与乙腈按体积比为95 5的混合) 得到混合液。在40°C下，并在淋洗剂以0. 5mL/min的流速的带动下，将20uL该混合液通入所述高效液相色谱仪中，使其依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触。由于柠檬酸发酵清液中各组分在固定相中滞留的时间不同，从而先后从固定相中流出，再经过检测器， 由记录仪记录色谱图。在同等条件下，将0. 5g的柠檬酸、0. 4g的葡萄糖、0. 4g的果糖、0. 2g 的麦芽二糖和0. 2g的麦芽三糖与IOOmL流动相混合，取20uL该混合液通过上述方法进行色谱分离，得到标准色谱图，如图3所示。通过与标准谱图对比便可得知所述柠檬酸清液中的组分以及各组分的含量，所得结果如下保留时间为15. 174min的是葡萄糖，含量为4. 20重量％ ；保留时间为16. 200min 的是果糖，含量为0. 01重量％ ；保留时间为13. 520min的是麦芽二糖，含量为1. 01重量％ ； 保留时间为12. 789min的是麦芽三糖，含量为0. 32重量％ ；保留时间为17. 713min的是柠檬酸，含量为10. 21重量％。从所得结果可以说明，在此条件下柠檬酸发酵液中残糖的组分与柠檬酸能够得到有效分离。实施例4本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸发酵清液的分析方法。(1)柠檬酸清液的提取按上述方法搅拌培养40小时后得到的柠檬酸浓度为 10.21重量％的柠檬酸发酵液，取50mL该柠檬酸发酵液，在室温(25 °C )、转速为4000rpm的条件下离心分离5min，得到上清液，即柠檬酸发酵清液。(2)色谱分析将步骤(1)所得的柠檬酸发酵清液用流动相稀释15倍(所述流动相为硫酸水溶液(浓度为0. OOSmol · L—1，pH为1. 99)与乙腈按体积比为97. 5 2. 5混合)得到混合液。在55°C下，并在淋洗剂以0.4mL/min的流速的带动下，将20uL该混合液通入所述高效液相色谱仪中，使其依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触。由于柠檬酸发酵清液中各组分在固定相中滞留的时间不同，从而先后从固定相中流出，再经过检测器，由记录仪记录色谱图。在同等条件下，将0. 5g的柠檬酸、0. 4g的葡萄糖、0. 4g的果糖、 0. 2g的麦芽二糖和0. 2g的麦芽三糖与IOOmL流动相混合，取20uL该混合液通过上述方法进行色谱分离，得到标准色谱图，如图4所示。通过与标准谱图对比便可得知所述柠檬酸清液中的组分以及各组分的含量，所得结果如下 保留时间为15. 428min的是葡萄糖，含量为4. 20重量％ ；保留时间为16. 458min 的是果糖，含量为0. 01重量％ ；保留时间为13. 975min的是麦芽二糖，含量为1. 01重量％ ； 保留时间为13. 477min的是麦芽三糖，含量为0. 32重量％ ；保留时间为20. 311min的是柠檬酸，含量为10. 21重量％。从所得结果可以说明，在此条件下柠檬酸发酵液中残糖的组分与柠檬酸能够得到有效分离。
权利要求
1.一种柠檬酸发酵清液的分析方法，所述柠檬酸发酵清液含有柠檬酸和糖，所述糖含有单糖和/或寡糖，其特征在于，所述方法包括使用色谱柱，所述色谱柱包括串联的反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱；在色谱分离条件下，将所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液从反相色谱分离柱的上端引入，依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触，并连续用淋洗剂洗脱所述反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱，将流出液A从离子排斥色谱柱的下端引出，所述流动相的组成和色谱分离的条件使得糖中的各组分以及柠檬酸先后被分离出来，并经色谱分析后得到保留时间和积峰面积，通过与同等条件下得到的标准谱图对比得到柠檬酸发酵清液中糖的组成和糖中的各组分含量以及发酵清液中柠檬酸的含量；所述淋洗剂和流动相的组成相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述柠檬酸发酵清液与流动相的体积比为 1 5-20。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流动相为有机溶剂和缓冲液的混合液；以所述流动相的总体积为基准，所述有机溶剂的含量为1-10体积％ ；所述缓冲液的含量为 90-99 体积 ％。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述有机溶剂选自乙腈、乙醇和异丙醇中的一种或多种；所述缓冲液为酸性水溶液，所述酸性水溶液中的酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或多种；所述缓冲液的浓度为0. 001-0. 02mol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述缓冲液的pH值为1.5-3。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱分离的条件包括所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液与所述反相色谱柱中填料的体积比为1 130-4000 ；所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液与离子排斥色谱柱中填料的体积比为1 400-14000 ；色谱分离的温度为20-80°C ；所述淋洗剂的流速为0. 1-1. 5mL/min。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液与所述反相色谱柱中填料的体积比为1 200-400;所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液与离子排斥色谱柱中填料的体积比为1 700-1400;所述色谱分离的温度为20-60°C;所述淋洗剂的流速为0. 4-0. 7mL/min。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述反相色谱柱的填料以二氧化硅为基体，在二氧化硅表面键合的官能团选自C4烷基、C8烷基和C18烷基中的一种；所述离子排斥色谱柱的填料为聚苯乙烯与二乙烯基苯共聚物，交换基团为-S03H。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单糖选自葡萄糖和果糖中的一种或多种；所述寡糖选自麦芽二糖和麦芽三糖中的一种或多种。
全文摘要
本发明公开了一种柠檬酸发酵清液的分析方法，其中，该方法包括使用色谱柱，所述色谱柱包括串联的反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱；在色谱分离条件下，将所述柠檬酸发酵清液和流动相的混合液从反相色谱分离柱的上端引入，依次与反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱接触，并连续用淋洗剂洗脱所述反相色谱分离柱和离子排斥色谱柱，将流出液A从离子排斥色谱柱的下端引出，并经色谱分析后得到保留时间和积峰面积，通过与同等条件下得到的标准谱图对比得到柠檬酸发酵清液中糖的组成和糖中的各组分含量以及发酵清液中柠檬酸的含量；所述淋洗剂和流动相的组成相同。采用本发明的方法对柠檬酸清液进行检测，不但能够将柠檬酸和糖分离，还能够检测出糖的具体的组成以及糖中各组分含量以及柠檬酸的含量，方法简单。
文档编号G01N30/02GK102313785SQ201110222319
公开日2012年1月11日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者周勇, 孙凤, 满云, 王慧娟, 陈影 申请人:中粮生物化学(安徽)股份有限公司