一株高产曲酸的米曲霉菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株米曲霉菌株及其应用，特别是一株高产曲酸的米曲霉菌株及其应用。
【背景技术】
[0002]在人体中，酪氨酸酶能催化酪氨酸与氧自由基经复杂氧化、聚合，最后合成黑色素。曲酸及其衍生物能通过抑制酪氨酸酶的活性而抑制黑色素形成，而且安全无毒，因而在化妆品和食品防腐保鲜等领域具有广泛的用途。在医药上，曲酸可以作为生产头孢类抗生素的中间体。同时，可作为合成香料中间体、杀虫剂原料等，在食品、化妆品、医药、农业、化工等行业有广泛的应用前景。许多曲霉如米曲霉、黄曲霉、疏展曲霉、构巢曲霉、寄生曲霉、白曲霉、烟曲霉、巨大曲霉、灰绿曲霉等和少数青霉，如产曲酸青霉等，能代谢产生曲酸。目前，生产中普遍使用的是米曲霉和不产生黄曲霉素的黄曲霉。1998年，周卫东等人报道米曲霉2336培养6.5d后产曲酸7.45g/L (周卫东，沈育芬，陈移亮，等.曲酸生产菌的诱变选育[J].亚热带植物通讯，1998，02:12-6)。沈卫荣等于2003年报道诱变前黄曲霉C-527的曲酸产量为9.26g/L(沈卫荣，沈俭，韩丽萍，等.曲酸生产菌的复合诱变选育[J].微生物学通报，2003，04:60-64)。2006年李一婧等人于2006年报道米曲霉QA96.8在诱变前曲酸产量为4.79g/L，即使经多次紫外诱变后，曲酸产量仅上升至18.13g/L(李一婧，马伟超.曲酸生产菌种的筛选和发酵工艺条件的优化[J].中国酿造，2006，06:42-44)。沈育芬等在2001年用米曲霉2336经紫外线诱变筛选到一株突变株，曲酸产量达到26.36g/L(沈育芬，陈移亮，周卫东，等.曲酸产生菌F31012变株的选育及发酵条件的研宄[J].福建师范大学学报(自然科学版)，2001，02:73-77)。因此，筛选曲酸高产优良菌株具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，已于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2014436，保藏地址为中国，武汉，武汉大学中国典型培养物保藏中心。
[0004]所述产曲酸米曲霉从土壤中筛选得到，其保藏条件如下:用无菌蒸馏水将斜面上的孢子洗出，玻璃珠打散后用带脱脂棉漏斗过滤制备孢子悬浮液。每个甘油管里面加入0.5mL孢子悬浮液和0.5mL 30%甘油，放入_70°C低温冰箱保存。
[0005]固态平板培养基为(w/v):5%葡萄糖，1%玉米淀粉，0.5%酵母膏，0.5% KH2PO4,0.25% MgSO4.7H20，琼脂粉 2%，自然 pH，灭菌。
[0006]液体种子培养基为(w/v):10%葡萄糖，2%玉米淀粉，1%酵母膏，0.5% KH2PO4,0.25% MgS04.7H20，用稀 HCl 调 pH 至 4.0，灭菌。
[0007]液体发酵培养基为(w/v):12%葡萄糖，1.0%豆饼粉，0.3%酵母膏，0.2% KH2PO4,0.02 % MgSO4.7H20，自然 pH,灭菌。
[0008]米曲霉的培养条件为:将已保藏甘油管的米曲霉孢子在固体平板培养基上划线，30°C培养5d后将孢子接入液体种子培养基，30°C，200rpm，摇床培养27h。以10% (v/v)的接种量将培养好的液体种子接种到发酵产酸培养基中，300C，200rpm，摇床培养。
[0009]将产曲酸米曲霉发酵后的发酵液，1000rpm离心2min，采用三氯化铁比色法测定离心后发酵上清液的曲酸产量。在发酵2d后开始生产曲酸，7d后曲酸产量可达25g/L。
[0010]本发明自土壤中筛选出一株产曲酸米曲霉，是一株曲酸产量较高的野生菌株。该菌株生产的曲酸可广泛应用于食品防腐保鲜、化妆品、医药、农业、化工等行业，具有重要的生产应用价值。
【附图说明】
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[0011]图1:曲酸测定标准曲线
[0012]图2:米曲霉筛选颜色反应及菌落形态
[0013]图3:曲酸发酵生产
【具体实施方式】
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[0014]实施例1:三氯化铁测定曲酸含量方法
[0015]曲酸测定标准曲线的制作:
[0016]1)0.1%曲酸标准溶液的制备:准确称取曲酸标准品0.1OOOg于10mL容量瓶中，加入适量蒸馏水使之完全溶解，并用蒸馏水定容至100mL，得到lmg/mL的曲酸标准溶液。
[0017]2)1.0% FeCl3-HCl 显色液制备:准确称取 FeCl3.6H20 1.0OOOg 于 10mL 容量瓶中，加入适量蒸馏水使之完全溶解，加入2mL浓盐酸，并用蒸馏水定容至100mL，得到1.0%FeCl3-HCl显色液，备用。
[0018]3)用移液管分别准确吸取0.1 %曲酸标准溶液0.5、1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5、4.0、4.5、5.0mL于100 mL容量瓶中，各加入2.0mL 1.0% FeCl3-HCl显色液，用蒸馏水定容至lOOmL，充分摇勾后，以蒸饱水加显色液作为空白对照，于500nm处测定不同浓度下的吸光值(A5_J。以曲酸浓度为横坐标、A5tltol值为纵坐标绘制标准曲线(图1)。
[0019]发酵液中曲酸测定:
[0020]将发酵液离心后，取上清液适当稀释，准确吸取1.0mL稀释液按标准曲线制作方法测定A—并根据曲酸标准曲线计算发酵液中曲酸的含量。
[0021]实施例2:产曲酸米曲霉筛选方法
[0022]采取一定量的土壤，放入装有10mL无菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振荡，稀释不同浓度梯度，将不同浓度梯度稀释好的样品分别涂布到筛选培养基平板上，于30°C恒温培养箱中培养3d。观察平板变色情况，挑取颜色深变色圈大的单菌落孢子接种于筛选培养基上，接种时以三点式法接种于察氏琼脂培养基平皿上，接种时务必避免孢子散落到平皿其它位置，之后将其置于霉菌培养箱中标准培养条件下培养7d。分离纯化培养直到无杂菌污染，接种于斜面保存，供下一步鉴定用。
[0023]所述固体筛选培养基(w/v)为:10%葡萄糖，2%玉米淀粉，1%酵母膏，0.5%KH2PO4,0.25% MgSO4.7Η20，0.1% FeCl3.6Η20，0.08%去氧胆酸钠，琼脂 2%,自然 pH，灭菌。
[0024]鉴定主要通过:1)菌落特征观察:菌落正面前期呈白色，后期呈褐色或淡绿褐色，背面无色，分生孢子较多，菌落中央稍呈疏松柱状，菌落呈现同心环状纹，菌落表面无渗出液。2)显色圈观察:颜色深变色圈大的单菌落(图2)。
[0025]挑选颜色深变色圈大的单菌落进行摇瓶发酵培养，取培养后的发酵液1000rpm离心2min，离心结束后，取上清液，适当稀释后通过三氯化铁比色法对发酵液中曲酸含量进行测定，筛选出一株曲酸产量较高的优良菌株，曲酸产量为25g/L左右，于2014年9月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM 2014436。
[0026]实施例3:曲酸发酵生产
[0027]将已保藏甘油管的米曲霉孢子在固体平板培养基上划线，30°C培养5d后将孢子接入液体种子培养基，30°C，200rpm，摇床培养27h。以10% (v/v)的接种量将培养好的液体种子接种到发酵产酸培养基中，30°C，200rpm，摇床培养。每隔24h取出ImL发酵液，将发酵液10000rpm、4°C条件下离心2min，收集上清液，并准确测量上清液的体积。将通过离心得到的上清液适当稀释后，准确吸取1.0mL稀释液按标准曲线制作方法测定A5tltlnm，并计算发酵液中曲酸的含量。该菌株发酵培养2d后开始产曲酸，培养7d后曲酸产量达到25g/L(图3)，因而是一株曲酸产量较高的优良野生菌株。
【主权项】
1.一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC M 2014436。
2.根据权利要求1所述的米曲霉，其特征在于该菌高产曲酸。
3.权利要求2所述的米曲霉，其特征在于培养2d后开始生产曲酸。
4.根据权利要求3所述的米曲霉，其特征在于30°C发酵7d后，曲酸产量可达25g/L。
5.权利要求1-4任一所述的米曲霉应用于生产曲酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于生产曲酸的发酵培养基组分为(w/v):12%葡萄糖，1.0%豆饼粉，0.3%酵母膏，0.2% KH2PO4,0.02% MgSO4.7H20。
7.根据权利要求1-4任一所述的米曲霉在食品防腐保鲜、化妆品、医药、农业、化工等行业有较广泛的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株高产曲酸的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，保藏编号CCTCC M 2014436。该菌株自土壤中筛选得到，30℃摇瓶发酵培养2d后开始产曲酸，发酵7d后，曲酸产量可达25g/L，是一株高产曲酸的优良野生菌株。曲酸具有较广泛的应用前景，主要用于食品防腐保鲜、化妆品、医药、农业和化工等行业。CCTCC NO:M201443620140920
【IPC分类】C12R1-69, C12P17-06, C12N1-14
【公开号】CN104531536
【申请号】CN201410564556
【发明人】杨海泉, 华珊, 宋江宁, 王一恬, 沈微, 陈献忠, 樊游
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年10月21日