黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用微生物防除农田杂草及农业杀菌剂的技术领域，尤其涉及一种黄 蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液及提取物在防除农田杂草和提 取物在农业杀菌剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 稗草Echinochloa crusgalli是世界性十大恶性杂草之一，是稻田、麦田和玉米 地等最重要的草害。稗草广泛分布于全国各地。常以优势草种生于湿润农田、荒地、路旁、 沟边及浅水渠塘和沼泽。对水稻、玉米、豆类、薯类、棉花、禾谷类和蔬菜等作物都有危害， 近年来已经上升为水稻产区第一恶性杂草，严重影响水稻产量及品质。反枝苋Amaranthus retroflexus是览属入侵种中发生频率最多、分布最广、危害最严重的杂草，为菜园、果园及 棉花和玉米等旱作物地中的常见杂草，并且该植物可富集硝酸盐，家畜过量食用后会引起 中毒，造成大量经济损失。目前对杂草的防除主要采用化学除草方法，但是化学除草剂具有 高毒性，易污染环境，导致抗性杂草的产生，研发成本高等不足之处。生物源除草剂具有资 源丰富、毒性小、不破坏生态环境、残留少、选择性强、对非靶标生物和哺乳动物安全、环境 兼容性好等优点。以杂草生物除防技术取代化学除草技术将可以缓解因化学除草剂的使用 所带来一系列问题。为了保护人类的生存以及环境和农业的可持续发展，生物源除草剂的 研究和开发得到了越来越多的重视，许多国家的研究工作者，纷纷对不同来源微生物生物 防治进行研究，希望从中找到微生物除草剂的候选菌。
[0003] -些植物致病真菌引起的作物减产是农业生产中需要解决的另一难题。植物致病 真菌能够引起农产品腐烂，坏死与萎蔫，造成严重经济损失，同时还可能导致如呕吐、腹泻、 诱发癌症等人类疾病的发生，给人类生产和健康带来了极大的危害。天然产物杀菌剂相比 化学杀菌剂具有环境污染小，可降解，不易产生耐药性等优点，已经成为研发新型农用杀菌 剂的重要方向。
[0004] 昆虫与微生物的共生是一种普遍存在的现象。昆虫的种类、数量及分布范围具有 复杂多样性，同时在昆虫个体体表以及体内共生着种类繁多的微生物，这些微生物在生态、 代谢特征、生理活性等方面均有一定的特殊性。昆虫肠道菌是一类研究较少的特境微生物。 据报道有些昆虫肠道菌能够产生一些结构新颖的活性代谢产物，这些代谢产物可能具有与 以往农用药剂不同的作用靶点，是开发新颖生物除草剂和杀菌剂的重要资源之一。在昆虫 肠道内生菌中寻找新的，安全有效，无毒无污染的微生物源除草剂及杀菌剂具有很强的可 行性。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia cr印inii QTYC-1。该菌于2014年7月1日保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 武汉市武昌珞珈山，邮编=430072,其保藏编号是：CCTCC M 2014308。
[0006] 本发明的黄蜻幼虫肠道真菌Curvularia crepinii QTYC-I是从一种黄蜻 (Pantala flavescen)幼虫肠道中筛选出的。
[0007] 菌落特征：一种黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-1，该菌为 Curvularia crepinii (Westend. )Boedijn，隶属于弯抱菌属（Curvularia)，格抱腔菌科 (Pleosporaceae)，格抱腔菌目（Pleosporales)，格抱腔菌亚纲（Pleosporomycetidae)，座 囊菌纲（Dothideomycetes),子囊菌门（Ascomycota),真菌界（Fungi)。在 MEA (生麦芽 20g， 加水煮沸30min，以纱布滤去残渣，滤液加水补足至lOOOmL，加入15-20g琼脂加热溶化，再 加蔗糖20g及蛋白胨lg，分装，120°C灭菌20min备用）培养基平板上恒温28°C培养10天， 直径可达70?80mm，菌丝初为浅绿色，后逐渐转为墨绿色，短绒状，紧凑，菌落近圆形、平 展，边缘不整齐（见图1)。菌丝无色或淡褐色，具隔膜，多分枝，宽2. O?4. 1 μ m。分生孢子 梗单生或簇生，产生于菌丝末端和中央细胞，少分枝，顶端屈膝状弯曲，具隔膜，端部颜色稍 浅，光滑，长可达160 μ m，宽2?7 μ m。分生孢子顶侧生，卵形有弯曲或近纺锤形，色较深， 端部细胞颜色渐浅，脐点不明显。
[0008] 采用新型快速真菌基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取 黄蜻幼虫肠道真菌Curvularia crepinii QTYC-I的纯培养物基因组DNA，运用rDNA内转 录间隔区（ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4,通过PCR扩增和测序分析得到5.8S序列。其 rDNA内转录间隔区（ITS)序列达到561bp，碱基序列如所示为： AGGGCTACAGGCAGGTATGAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGGGCCAGTTTTGCGGAGGCTGAATTATTT ATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGGTTCGCCCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTT TTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGG GCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGCAGCGCAGCAC ATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCATCAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTA GGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 测序结果递交http ://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast进行比对，与其亲缘关系较 近的Curvularia crepinii (KF572448. 1)序列相似性达100%，序列比对覆盖率达97%。 结合其形态学特征，确定该菌株为Curvularia crepinii,命名为Curvularia crepinii QTYC-I。
[0009] 本发明的第一个目的是提供黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液在除草中的用途。其特征在于，一种杂草生防菌剂，采用以下方法制备：将 黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I接种于培养基，温度28°C，摇床转数 180r/min，培养得到的发酵液即为稗草生防菌剂；其中，培养基的配方为：每IL蒸馏水中， 含麦芽提取物20g，蔗糖20g，蛋白胨lg，pH 7.0 本发明的第二目的是提供上述黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I 发酵液及发酵液提取物作为生物除草剂的应用。其特征在于以黄蜻幼虫肠道内生真菌 Curvularia crepiniiQTYC-Ι作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体后得其 发酵液，发酵液用乙酸乙酯1 : 1等体积萃取，萃取液经浓缩后即得黄蜻幼虫肠道内生真菌 Curvularia crepinii QTYC-1 发酵液提取物。
[0010] 本发明通过实验发现，黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵 液对稗草幼苗和幼根具有强烈的生长抑制作用，其最大抑制率分别可达95. 0%和90. 1%， 并可使经喷施发酵液的稗草幼苗的受害率达到71. 1 %。黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-1 发酵液提取物在 100 μ g/mL 浓度下，对稗草（Echinochloa crusgalli)、 反枝览（Amaranthus retroflexus)、的抑制率分别为56. 8 %和71. 2%，并且对常见农作 物具有很好的安全性。由此可见，本发明黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I的发酵液与提取物具有除草活性，可用来制备除草剂。 本发明的第三个目的是提供一种除草剂，该除草剂包含黄蜻幼虫肠道内生真菌 Curvularia crepinii QTYC-I发酵液提取物作为活性成分。
[0011] 所述的除草剂优选为稗草（Echinochloa crusgalli)和反枝览（Amaranthus retroflexus)除草剂。
[0012] 本发明的第四个目的是提供一种杀菌剂，该杀菌剂包含黄蜻幼虫肠道内生真菌 Curvularia crepinii QTYC-I发酵液提取物作为活性成分。
[0013] 所述的杀菌剂优选为杨树溃瘍病菌（Dothiorella gregaria)、番爺早疫病菌 (Alternaria solani)、苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp. momordicae)、黄瓜枯萎 病菌（Fusarium. oxysporumf. sp. cucumerinu)和小麦赤霉病菌（Gibberella sanbinetti) 杀菌剂。
[0014] 有益效果：本发明提供的黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepiniiQTYC-Ι菌 株，是一种黄蜻幼虫肠道内生真菌，对稗草和反枝苋幼根抑制作用强，生防试验效果好；其 代谢产物对一些植物致病真菌具有很好的抑制作用。该菌培养条件简单，易于保存和生 产，发酵液既可作为除草剂，免去复杂的生产工艺，可重复性好，在农田杂草生物防治中能 够起到非常重要的作用，特别是对稗草及一些植物致病真菌的防治具有重要的意义，是一 种具有良好开发应用前景的有效除草剂和杀菌剂。
[0015]
【附图说明】： 图1黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia cr印inii QTYC-I在麦芽汁琼脂培养基上菌 落生长情况 图2基于黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-15.8S rDNA基因片段序 列构建的系统发育树 图3黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液抑制反枝览效果统 计图 图4黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液抑制稗草效果统计 图 图5黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液乙酸乙酯提取物除 草活性及安全性效果统计图 图6黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液乙酸乙酯提取物对 植物致病真菌抑制活性统计图
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
[0017] 实施例1菌株的分离筛选 供试黄蜻幼虫采自浙江师范大学校园附近河流（29 ° 00' 17. 37"N， 119° 29'54. 84"E)。将健康黄蜻幼虫用75%酒精表面消毒2min，无菌水冲洗3次，解剖后 得到的肠道放至无菌研钵内进行研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成ιοΛιοΛκτ 3,分别 取各梯度稀释液〇. 2mL涂布于MEA培养基（配方：麦芽提取物20g，蔗糖20g，琼脂20g，蛋 白胨lg，蒸馏水1L，pH 7.0)平板上，28°C恒温箱中培养。待菌落长出后，从菌落边缘挑取 少量菌丝，再次转接MEA培养基平板上，由此获得一株菌株纯培养物，命名为QTYC-I，并被 保存于保藏