蜻蜓幼虫肠道纤维素降解真菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种木霉Trichoderma?sp.QTYC-44，其保藏号为CCTCC?NO：M2014267。本发明还同时公开了上述木霉Trichoderma?sp.QTYC-44在产纤维素酶中的应用。本发明还同时公开了上述木霉Trichoderma?sp.QTYC-44在纤维素等生物质降解中的应用。
【专利说明】蜻蜓幼虫肠道纤维素降解真菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种蜻蜓幼虫肠道纤维素降解真菌新种 Trichoderma sp. QTYC-44及其在生产纤维素酶和在纤维素等生物质降解中的应用。
【背景技术】
[0002] 昆虫共生菌长期与昆虫保持共生关系，是一类具有特殊生态作用的微生物。昆虫 物种的多样性和栖息环境的复杂性决定了昆虫共生菌物种的丰富性和独特性，是微生物新 物种的重要来源。然而该类特境微生物尚未得到充分开发和利用。作为寄主的昆虫有如下 发生特点：（1)种类数量多；据估计，地球上的昆虫约有300万种，目前已报道的昆虫有100 多万种，约占已知动物种类的2/3,植物的已知种类只有昆虫种类的1/3左右。（2)个体数量 大；昆虫不仅种类多，而且同种的个体数量十分惊人，如一棵树可拥有10万多头蚜虫个体， 一个蚂蚁群体可多达50多万个个体。（3)分布范围广；昆虫能够栖息于地球上几乎所有角 落。据报道昆虫之所以能发展成为动物界中数量最多、个体数量最大、分布范围最广的自然 类群，这与其繁殖力强及口器特化等有关外，还与昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物和抵抗 致病菌等有关（Zhang et al，2008)。昆虫种类、数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道 菌的多样性。这些大量的昆虫肠道菌是微生物新种的重要来源，如Suh等从甲虫肠道中鉴 定的650个菌株中有超过200个是新种，White等从水生昆虫肠道中鉴定的25种真菌中有 超过9个是新种，其中一个是新属种，这些新种可能是新微生物资源重要来源。虽然国内外 关于纤维素降解菌株的研究报道有很多，但来源于昆虫肠道菌的纤维素降解微生物的研究 报道却很少，故应加强对昆虫肠道菌中纤维素降解微生物等生物质资源的发掘与利用。
[0003] 随着环境问题日益突出，对秸杆、城市垃圾、塑料、纤维素、石油资源、有机农药等 有机污染物的生物降解以及利用研究，已成为社会可持续发展的重要特征目标。美国政府 通过立法形式为自己规定了必须实现的目标：2022年要生产360亿加仑可再生燃料，其中 约半数要靠纤维素乙醇；2030年要用可再生燃料来替代30%的液体石化燃料。为实现上述 目标，美国政府加大了相应的投资力度：2007年宣布投资10余亿美元，包括：投入3. 75亿 美元同时建立3个生物能源研究中心，吸引一流大学和研究机构参与相关的基础研究，同 时，投资3. 85亿美元，吸引企业1 : 2匹配，总投资12亿美元，用于6个万吨级以上的纤维 素生物炼制厂建设，希望利用发展新能源来保住自己的超级大国地位（方诩，等.纤维素 酶与木质纤维素生物降解转化的研究进展.生物工程学报，2010, 26(7) :864-869.)。我国 是农业大国，每年可产生大量的秸杆纤维素，但主要是通过传统简单的焚烧方式利用，能源 利用率极低，环境污染较大。如何高效地利用纤维素资源已成为关乎国家能源安全的重要 议题。由于微生物在纤维素利用方面的独特优势，寻找新的纤维素利用菌种和开发高产纤 维素酶菌种，是纤维素资源高效利用的关键。
[0004] 曾华兰等人报道过桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride)对丹参根腐病有较好 的防效，可用于防治丹参根腐病，但未对其产纤维素酶活性进行研究（曾华兰，等.利用木 霉防治丹参根腐病的研究.四川农业大学学报，2003, 21(2) :142-144.)。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种从黄蜻（Pantala flavescen)幼虫肠道中筛 选出的、具有较高的纤维素降解活性的真菌新种---木霉Trichoderma sp. QTYC-44及其用 途。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种木霉Trichoderma sp. QTYC-44,其保藏 号为 CCTCC NO :M2014267。
[0007] 本发明还同时提供了上述木霉Trichoderma sp. QTYC-44在产纤维素酶中的应用。
[0008] 本发明还同时提供了上述木霉Trichoderma sp. QTYC-44在生物质降解中的应用。
[0009] 作为本发明的木霉Trichoderma sp. QTYC-44在生物质降解中的应用的改进：所 述生物质为纤维素。
[0010] 该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏名称 Trichoderma sp.QTYC-44,保藏编号：CCTCC N0:M2014267,保藏日期 2014 年 6 月 17 日。
[0011] 本发明的黄蜻幼虫肠道中纤维素降解真菌新种：木霉Trichoderma sp. QTYC-44 是一种黄蜻（Pantala flavescen)幼虫肠道中筛选出的菌。
[0012] 菌种描述：在MA (麦芽汁琼脂）培养基上菌落生长较快，28°C黑暗条件下3天菌 落直径60-65_，靠近菌落边缘的部分可见白色分生孢子簇。分生孢子簇排列较为稀疏，不 产生扩散性色素，没有明显气味。分生孢子梗直接产生瓶梗或产生二级分枝，二级分枝倾向 于对生。分生孢子椭圆形，浅绿色，壁光滑。该菌株可以在以新华滤纸片为唯一碳源的试管 中生长，且滤纸片在5天内发生明显崩解，优于同等条件下中国菌种保藏中心（武汉大学） 产纤维素酶标准菌株绿色木酶（编号为AF93255)。表明具有较高的生物质降解活性。
[0013] 按照常规方法从木霉Trichoderma sp. QTYC-44的纯培养物提取基因组DNA，运用 rDNA内转录间隔区（ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4,通过PCR扩增和测序分析得到ITS 序列。
[0014] 在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通 过Clustal-X软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树（见图3)，进行系 统发育分析。从系统发育树可以看出木霉Trichoderma sp. QTYC-44与已知的真菌桔绿木 霉（Trichoderma citrinoviride))具有较大的差异性。其rDNA内转录间隔区（ITS)序 列达到723bp，其BLAST序列比对覆盖率约只有76%，与其亲缘关系较近的Trichoderma citrinoviride (HM776434. 1)序列相似性只有95 %。结合其形态学特征，我们确定它是一 株真菌新种，将其归入肉座菌科（Hypocreaceae)，命名为木霉Trichoderma sp. QTYC-44。 该菌保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏名称 Trichoderma sp.QTYC-44,保藏编号：CCTCC N0:M2014267,保藏日期 2014 年 6 月 17 日。
[0015] 对本发明的菌株木霉Trichoderma sp. QTYC-44的纤维素酶活（CMC酶活）研究表 明：木霉Trichoderma sp. QTYC-44在28°C、pH7. 0条件下液体发酵，发酵液的纤维素酶活在 6d后发酵液纤维素酶活达到1654. 6U/mL。同时用含有木霉Trichoderma sp. QTYC-44的菌 液制剂进行新华滤纸片降解试验。结果表明：经过5天的降解处新华滤纸片可以完全崩解， 由此说明木霉Trichoderma sp. QTYC-44具有较好的纤维素等生物质降解活性。因此本发 明的第二个目的是提供木霉Trichoderma sp. QTYC-44在产纤维素酶中的应用。
[0016] 综上所述，本发明提供了一种真菌新种：木霉Trichoderma sp. QTYC-44,该菌具有 产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。本 发明提供的菌株具有较好的产酶活性可应用于生产纤维素酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0018] 图1是Trichoderma sp. QTYC-44菌落在固体麦芽汁培养基上生长情况；
[0019] 图 2 是 Trichoderma sp. QTYC-44 分生抱子梗图片；
[0020] 图3是Trichoderma sp. QTYC-44在rDNA内转录间隔区（ITS)无根系统发育树中 位置图；
[0021] 图4是经Trichoderma sp. QTYC-445天降解处新华滤纸片崩解程度；
[0022] 从左至右的1-4个试管为空白对照组（未接菌）；从左至右的5-10个试管为接种 Trichoderma sp. QTYC-445天降解处新华滤纸片崩解程度实物图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
[0024] 实施例1、菌株的分离筛选
[0025] 供试黄蜻幼虫采自浙江师范大学校园附近河流。将健康黄蜻幼虫用75% (体 积％ )酒精表面消毒2min，无菌水冲洗3次，解剖后得到的肠道放至无菌研钵内进行研磨， 用无菌水对研磨液梯度稀释成ΚΓ1，1〇_ 2,1〇_3,分别取各梯度稀释液〇. 2mL涂布于MEA培养 基（配方：麦芽20g，蔗糖20g，琼脂20g，蛋白胨lg，蒸馏水定容至1L，pH7. 0)平板上，28°C 恒温箱中培养。待菌落长出后，从菌落边缘挑取少量菌丝，再次转接MEA培养基平板上，由 此而获得一株菌株纯培养物，命名为QTYC-44,保存于保藏培养基（配方为：麦芽20g、蔗糖 20g、琼脂20g、蛋白胨lg、蒸馏水1L，pH7. 0,120°C灭菌20min)中。
[0026] 实施例2、真菌QTYC-44的鉴定
[0027] 1、形态学鉴定
[0028] 菌株的形态学初步鉴定依据《半知真菌鉴定手册》。如图1所示，在MA(麦芽汁琼 脂）培养基上菌落生长较快，28°C黑暗条件下3天菌落直径60-65_，靠近菌落边缘的部分 可见白色分生孢子簇。分生孢子簇排列致密，不产生扩散性色素，没有明显气味。分生孢子 梗直接产生瓶梗或产生二级分枝，二级分枝倾向于对生。分生孢子椭圆形，浅绿色，壁光滑。 该菌株可以在以新华滤纸片为唯一碳源的试管中生长，且滤纸片在5天内发生明显崩解， 表明具有较高的生物质降解活性。
[0029] 2、菌株分子生物学鉴定
[0030] 菌株的DNA提取，PCR扩增及扩增产物的序列分析：将培养4d的新鲜菌体作为DNA 提取材料，采用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提 取菌株基因组DNA，1 %琼脂糖凝胶电泳检测纯度。以上述提取的基因组DNA为模板，用引 物 ITS1 (forward):ITS1 (5_，TCCGTAGGT GAACCTGCG G-3,），ITS4 (reverse):ITS4(5_，TCCTC CGCTTATTGATATGC-3'）对供试菌株rDNA的ITS区域进行PCR扩增。反应液体积50 μ L，包 括：38.8yL ddH20,4.0yL10XPCRbuffer，4.0yL d NTPs，ITSl、ITS4 各 l.OyL，菌株基因 组模板1. ο μ L，0. 2 μ L Taq DNA聚合酶。PCR反应程序：94°C预变性2min ;94°C变性lmin， 55°C复性lmin，72°C延伸lmin，进行35个循环；最后72°C延伸5min，16°C保存。PCR产物 用2%琼脂糖凝胶测其纯度。PCR扩增产物经检测后送至上海生工生物工程有限公司进行 测序，测序引物为ITS1。
[0031] 测序结果如下：
[0032] GGGCCTCGAGTTAACTCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTGCCC CGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCC TACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA TTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATT TCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCCCCCCCGAAATACGATGGCGG TTTCGCCCCACCCTCGCCTGCATGGTAGTTTGCACACTCGAACCGGCCGGCGCGGACGACCACGCCCAGGAAACACC CCGAACTCGGAAATGTTGACCTCGGAAGTGGTAAGAACGCCGATGATCCTTCCGCAGTCGCTAACAGAGGGACTAGT ACCGAGTGTGCATATCCCAAACAAAAGGTGAACGTTACAATCTGTTGCTCGTCGGGATTCTCTGCCCGGGCGCGACA CACCCGGTATCCAGGAGGCGTGAAAGACAAATCAACCT
[0033] 在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通 过Clustalxl. 83软件和MEGA5. 0软件以Neibor-joining方法构建系统进化树（见图3)， 进行系统发育分析。从系统发育树可以看出木霉Trichoderma sp. QTYC-44与已知的真 菌具有较大的差异性。其rDNA内转录间隔区（ITS)序列达到723bp，其BLAST序列比对 覆盖率约只有76%，与其亲缘关系较近的Trichoderma citrinoviride(HM776434.1)序 列相似性只有95%。结合其形态学特征，我们确定它是一株真菌新种，将其归入肉座菌科 (Hypocreaceae)，命名为木霉 Trichoderma sp. QTYC-44。
[0034] 将该菌保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏 名称 Trichoderma sp. QTYC-44,保藏编号：CCTCC NO :M2014267,保藏日期 2014 年 6 月 17 曰。
[0035] 实施例3、纤维素酶活（CMC酶活）的测定
[0036] 将6块木霉Trichoderma sp. QTYC-44菌饼（直径为6mm)接种于250ml发酵培 养基（配方：麦芽2(^、蔗糖2(^、蛋白胨18、蒸馏水11^，？!17.0，1201：灭菌201^11)中，281：、 pH7. 0条件下，发酵6d，取少量的发酵液测定发酵液的纤维素酶活性。发酵液经4500r/min 离心20min，上清液作为粗酶液。取4支试管，1支管作空白对照，3支管作平行样品管，每支 样品管中加 lmL粗酶溶液，置于50°C水浴锅中预热2min,然后在3支试管中分别加入4mL 已预热至50°C的底物溶液（底物溶液的制备方法为：准确称取0.625g羧甲基纤维素钠盐， 溶于100mL醋酸钠缓冲溶液（0. 2mol/L，pH值为4. 6)，加热搅拌使之溶解），在水浴锅中加 热30min，往4支试管内加入1. 5mL DNS显色液（DNS显色液的制备方法为：称量90. 996g酒 石酸钾钠溶于250mL蒸馈水中，加热，趁热加入3. 1565g的3, 5-二硝基水杨酸（DNS)，另配 制2mol/LNa0H溶液，取131ml加入上述溶液中，称量2. 564g苯酚和2. 532g无水亚硫酸钠 移入配置好的溶液中，蒸馈水定容至500mL),摇匀后置于沸水浴中加热5min后流水冷却， 蒸馏水定容至25mL，于520nm下测定各管的0D值，对照葡萄糖标准曲线，得出还原糖含量。 在该条件下，每30min产生1 μ g还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U/mL)。实验结 果表明木霉Trichoderma sp. QTYC-44发酵6d后发酵液纤维素酶活达到1654. 6U/mL。由此 表明本发明的木霉Trichoderma sp. QTYC-44具有产纤维素酶活性。
[0037] 实施例4、纤维素生物质降解活性测试
[0038] 将木霉Trichoderma sp. QTYC-44接种到固体PDA平板上，等菌落长到一定大小后 用6cm打孔器取三块菌饼接种分别接种到含有5mL的新华滤纸片降解实验培养基中（制备 方法为：滤纸条培养基：(NH 4)2S04lg，KH2P04lg，MgS04 ·7Η200· 7g，NaC10. 5g，加水至 1000mL。 每个试管分装5mL滤纸条培养基，放置6cmX lcm新华定量滤纸条，120°C灭菌20min)，28°C， 180r/min摇培5d，新华滤纸片完全崩解。
[0039] 对比实验1 :
[0040] 以中国菌种保藏中心（武汉大学）产纤维素酶标准菌株绿色木酶（编号为 AF93255)代替上述木霉Trichoderma sp. QTYC-44,按照上述实施例3和实施例4进行检测， 结果为：摇培5d时，新华滤纸片崩解度为89%。当摇培6d，新华滤纸片才完全崩解。发酵 6d后发酵液纤维素酶活达到1575. 2U/mL。
[0041] S卩，在同等条件下，本发明的木霉Trichoderma sp. QTYC-44菌株相对于AF93255 具有较好的纤维素等生物质降解活性。
[0042] 对比实验2、
[0043] 对比实验，将桔绿木霉按照上述实施例3、实施例4所述方法进行检测，所得结果 分别为：发酵6d后桔绿木霉发酵液纤维素酶活达到654. 6U/mL ;桔绿木霉摇培8d，新华滤 纸片才完全崩解。
[0044] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
[0001] 说明书核苷酸和氨基酸序列表 <110〉浙江师范大学 <120〉蜻蜓幼虫肠道纤维素降解真菌及其应用 <160> 1 <210〉 1 <211〉 723 <212> DNA <213〉黄蜻（Ρα财o/α/Zflveyce/?) <400> 1 gggcctcgag Llaactccaa acccaaLgtg aacgllacca atctgtlgcc tcggcgggat 60 tclclgcccc gggcgcgtcg cagccccgga tcccalggcg cccgccggag gaccaactca 120 aaclctUU ictctccglc gcggcclacg Icgcggctct gUtlaUtl tgctclgagc 180 clttctcggc gaccctagcg ggcglcicga aaalgaalca aaaclttcaa caacggalci 240 cttggltctg gcatcgalga agaacgcagc gaaatgcgat aaglaatglg aatlgcagaa 300 tlcagtgaal calcgaatct ttgaacgcac attgcgcccg ccaglattci ggcgggcatg 360 cctglccgag cgicatuca acccicgaac ccctccgggg ggicggcglt ggggaicggc 420 ccctcaccgg gccccccccg aaatacgatg gcgglticgc cccaccclcg cclgcatggi 480 agltlgcaca clcgaaccgg ccggcgcgga cgaccacgcc caggaaacac cccgaactcg 540 gaaatgUga cclcggaagt ggtaagaacg ccgatgatcc itccgcaglc gctaacagag 600 ggaciagtac cgagtgtgca talcccaaac aaaaggtgaa cgttacaalc tgttgctcgl 660 cgggaltclc tgcccgggcg cgacacaccc ggtatccagg aggcgtgaaa gacaaalcaa 720 cct 723
【权利要求】
1. 木霉 Trichoderma sp. QTYC-44,其特征是：保藏号为 CCTCC N0:M2014267。
2. 根据权利要求1所述的木霉Trichoderma sp. QTYC-44在产纤维素酶中的应用。
3. 根据权利要求1所述的木霉Trichoderma sp. QTYC-44在生物质降解中的应用。
4. 根据权利要求3所述的木霉Trichoderma sp.QTYC-44在生物质降解中的应用，其特 征是：所述生物质为纤维素。
【文档编号】C12R1/885GK104099252SQ201410325510
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】张应烙, 邵明伟, 卢贻会, 潘霞, 金洁茹 申请人:浙江师范大学