生物法制备茶氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物法制备茶氨酸的方法，包括使用保藏编号为CCTCCNO：M2014254的硝基还原假单胞菌NTLC4.002为出发菌株制备细胞、细胞转化法制备天然茶氨酸。本发明从中国传统发酵制品中分离筛选得到一株新型的可用于生产茶氨酸的菌株，其所产的谷氨酰胺酶，在pH9～10、35～40℃的条件下，通过作用于谷氨酰胺和乙胺，可以高效的生产茶氨酸，转化率可达80%以上。
【专利说明】生物法制备茶氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物法制备茶氨酸的方法，尤其涉及一株可用于高效生产茶氨酸 的硝基还原假单胞菌株。
【背景技术】
[0002] 茶氨酸（L-theanine)是茶叶特有的一种氨基酸，其含量直接决定茶叶的品质。此 夕卜，茶氨酸还同时具有降血压、抗肿瘤、保护神经、放松、抗抑郁、抗疲劳、提高免疫力、减轻 体脂等作用。L-茶氨酸的多种生理功能及良好的稳定性和安全性，使其在食品、保健品方面 有着广泛的需求和应用。
[0003] 由此，一直以来人们尝试了多种制造茶氨酸的方法，目前主要有三种制造方法。第 一，是从茶叶中提取的方法。但由于干茶叶中的茶氨酸含量仅有1.5%左右，且光合作用会 使茶氨酸损失一部分，致使产量很低。随后发明了化学有机合成茶氨酸的方法。但该法可 能会残留毒性物质，且生成物包括D、L-型茶氨酸异构体，需要进行拆分才能得到L型产 品，使得分离精制操作复杂。第三种制造方法，是利用微生物酶法进行生产。目前报道了微 生物来源的谷氨酰胺酶酶法生产茶氨酸的方法，如来自假单孢菌属、以及2005年公开的来 自香茅醇假单孢菌GEA和2007年公开的来自芽孢杆菌属、霉菌或酵母菌中的1种或2种以 上的谷氨酰胺酶，2008年公开了一种利用来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰转肽酶生产茶氨酸 的方法，该方法安全可靠，但存在着需要制备酶粉及可能使用到有机溶剂，造成工业生产操 作复杂等问题。目前未见任何利用来自硝基还原假单胞菌进行细胞转化生产茶氨酸的报 道。利用来自硝基还原假单胞菌的谷氨酰胺酶酶法制备茶氨酸，酶源制备方法简单，由于该 酶属于胞内酶，可直接利用细胞转化及菌体或酶的固定化进行茶氨酸的生物制备，具有酶 与底物容易分离，转化产物纯度高等开发优势，且可进行高浓度的底物转化来制备茶氨酸。
【发明内容】
[0004] 本发明是鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于提供操作简单且有效的生物法 制备茶氨酸的方法。
[0005] 本发明的技术解决方案是： 一种产生谷氨酰胺酶的菌株，其特征是：其分类命名为硝基还原假单胞菌 (Pseudomonas nitroreducens) NTLC4. 002,保藏编号：CCTCC NO :M2014254。
[0006] -种生物法制备茶氨酸的方法，其特征是：包括下列步骤： (1) 制备细胞： 使用保藏编号为CCTCC NO :M2014254的硝基还原假单胞菌NTLC4. 002为出发菌株； 培养基，以g/L计为：葡萄糖10-18、酵母抽提物0. 7-1. 2、谷氨酸钠9-15、MgS04 · 7H20 0. 45-UK2HP04 0. 45-UKH2P04 0. 45-UEDTA-Fe 0. 06-0. 11,pH 6. 7-7. 2 ；35-38〇C,200 rpm的条件下培养16 h ;冷冻离心，获得菌体； (2) 细胞转化法制备天然茶氨酸： 将制备的细胞置于含0. 2?0. 4M谷氨酰胺和1. 5?2. 5M乙胺的pH为9?10的 50?100mM Na2B407-Na0H硼酸钠缓冲液中，在35?40°C下进行2?8小时的酶反应，制 得茶氨酸。
[0007] 本发明的有益效果：发明人等为了解决上述问题，从中国传统发酵制品中分离筛 选得到一株新型的可用于生产茶氨酸的菌株，其所产的谷氨酰胺酶，在PH9?10、35?40°C 的条件下，通过作用于谷氨酰胺和乙胺，可以高效的生产茶氨酸，转化率可达80%以上。
[0008] 根据本发明，能提供高效的制造茶氨酸的新方法，能使茶氨酸的生产简单，并利于 工业化生产。
[0009] 生物材料样品保藏 上述茶氨酸生产菌是本发明人等首次发现鉴定的新型菌株，分类命名为硝基还原假 单胞菌NTLC4. 002,拉丁文学名：fliiroret/wcefls ;保藏单位：中国典型培 养物保藏中心，地址：中国武汉大学，保藏日期=2014年6月13日，保藏编号：CCTCC N0: M2014254。
[0010] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0011] 图1是表示利用称干重法和比浊法测定的硝基还原假单胞菌生长曲线。
[0012] 图2是表示通过高效液相色谱法检测的茶氨酸含量的图表。
【具体实施方式】
[0013] 下面，详细说明本发明的实施方式，但本发明的技术范围不受限于下述实施方式， 在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范 围。
[0014] 本发明的茶氨酸是指N-乙基-Y -谷氨酰胺，是茶叶特有的一种氨基酸，是绿茶中 有效的呈味物质，可以用作品质、风味改良剂及功能食品添加剂。
[0015] 本发明中使用的乙胺衍生物，可以列举乙胺、乙胺盐酸盐等。
[0016] 本发明所用的硝基还原假单胞菌NTLC4. 002是由本发明人等发现的新菌株，是具 有产生谷氨酰胺酶的茶氨酸生产菌。另外，本发明所用的硝基还原假单胞菌NTLC4. 002鉴 定，是通过根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16s RNA序列的测定而得出 的。
[0017] 本发明的谷氨酰胺酶是来自硝基还原假单胞菌NTLC4. 002的酶。该酶在碱性条件 下，具有转移活力，可以催化谷氨酰基转移反应。该反应的酶活性源存在于菌体内，可直接 通过离心获得菌体，即酶源。
[0018] 本发明中的谷氨酰胺酶活性，通过该酶可以将谷氨酰基转移到盐酸羟胺上，定量 所生成的L-谷氨酸-γ -单羟肟酸而测定。该酶的单位定义为每分钟生成1 μ mol的L-谷 氨酸-Y -单羟肟酸所需要的酶量。
[0019] 实施例1产谷氨酰酶菌的分离 取少许待分离土壤加入到分离培养基中（以g/L计）：葡萄糖15、酵母膏12、玉米浆10、 MgS04,7H20 0· 5、Κ2ΗΡ041，ρΗ7·0。在 37°C，200rpm 的条件下培养 24h，经稀释涂布后，获 得纯培养物，37°C培养30h，得到23株酶活较高的菌株，最后选定一株酶活可达到0. 2U/mL 的菌株作为实验菌株。
[0020] 实施例2获得菌体 使用实施例1所得到的硝基还原假单胞菌SK16. 004,在发酵培养基中（以g/L计):葡萄 糖 12、酵母抽提物 0· 9、谷氨酸钠 12、MgS04 ·7Η20 0· 5、K2HP04 0· 6、KH2P04 0· 6、EDTA-Fe 0. l，pH 6. 8-7. 0,35-37°C，200 rpm的条件下培养16 h;冷冻离心，获得菌体，即为酶源。
[0021] 实施例3酶反应 使用实施例2的酶源，在含谷氨酰胺0. 3M、乙胺(或乙胺盐酸盐)1. 5M的50mM硼酸钠缓 冲液（Na2B407-Na0H、pH10)中，在37°C下进行2?8小时的酶反应，合成了茶氨酸。
[0022] 实施例4茶氨酸产量的测定 将实施例3中进行的酶反应液经TCA沉淀、稀释，通过安捷伦液相色谱仪，分别对茶 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸进行定量。分析条件如下：仪器型号：Agl260,色谱柱：C18,柱温： 40。。。
[0023] 实施例5硝基还原假单胞菌NTLC4. 002培养条件的优化 本发明人等研究了使用实施例1中的培养基以外的培养基硝基还原假单胞菌 NTLC4. 002的培养。在研究了葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖等碳源后，结果发 现，使用葡萄糖时发酵液上清液酶活最高。在研究了氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酰胺、谷 氨酸钠、酵母抽提物、牛肉浸膏和蛋白胨氮源后，结果发现，使用酵母抽提物可以达到最佳 效果。同时研究了葡萄糖、酵母抽提物、谷氨酸钠最佳浓度比后发现，葡萄糖、酵母抽提物、 谷氨酸钠分别为10?18 g/L、0. 7?1. 2 g/L、9?15g/L的条件下，可得到酶活较高的发 酵液。
[0024] 实施例6使用来自硝基还原假单胞菌NTLC4. 002的谷氨酰胺酶酶反应条件的最 优化。按照实施例3中的酶反应条件，研究了使用来自硝基还原假单胞菌NTLC4. 002的谷 氨酰胺酶最适酶反应条件，发现使用〇. 3M谷氨酰胺与1. 5M乙胺，在37°C，pHIO条件下反应 2?8小时可得到最大收率的茶氨酸。
【权利要求】
1. 一种产生谷氨酰胺酶的菌株，其特征是：其分类命名为硝基还原假单胞菌 (Pseudomonas nitroreducens) NTLC4. 002,保藏编号：CCTCC NO :M2014254。
2. -种生物法制备茶氨酸的方法，其特征是：包括下列步骤： (1) 制备细胞： 使用保藏编号为CCTCC NO :M2014254的硝基还原假单胞菌NTLC4. 002为出发菌株； 培养基，以g/L计为：葡萄糖10-18、酵母抽提物0. 7-1. 2、谷氨酸钠9-15、MgS04 · 7H20 0. 45-UK2HP04 0. 45-UKH2P04 0. 45-UEDTA-Fe 0. 06-0. 11,pH 6. 7-7. 2 ；35-38〇C,200 rpm的条件下培养16 h ;冷冻离心，获得菌体； (2) 细胞转化法制备天然茶氨酸： 将制备的细胞置于含〇. 2?0. 4M谷氨酰胺和1. 5?2. 5M乙胺或乙胺盐酸盐的pH 为9?10的50?lOOmM Na2B407-Na0H硼酸钠缓冲液中，在35?40°C下进行2?8小时 的酶反应，制得茶氨酸。
【文档编号】C12R1/38GK104087535SQ201410325370
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】帅玉英, 江波, 张涛, 孙怡, 吴晓花, 沈宇峰 申请人:南通励成生物工程有限公司