专利名称：一种酶法合成l-茶氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种L-茶氨酸的合成方法，尤其涉及一种以L-谷氨酰胺的二价金属离子配合物为谷氨酰供体，利用Y -谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的方法。
背景技术：
茶氨酸是绿茶、红茶和乌龙茶中所含的一种特殊氨基酸，属酰胺类化合物，是茶叶的特征氨基酸，也是茶叶的主要呈味物质之一。天然存在的茶氨酸均为L型，除了调味之外，还具有消除疲劳、促进大脑机能增强学习记忆能力、降血压、改善睡眠、放松情绪的功能，可用于抑郁症的预防和临床治疗；抗肿瘤作用和提高抗癌药物的疗效；因此，L-茶氨酸可用于药品，保健品，化妆品等各行业。目前L-茶氨酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法和提取法。化学合成法制备 L-茶氨酸采用的均为谷氨酸的衍生物与乙胺或乙胺化合物反应，涉及到谷氨酸的保护与脱保护，反应路线复杂，条件苛刻，副反应多，且容易产生消旋体，同时大量有机溶剂会污染环境。而发酵法有以下不足产物浓度和转化率较低、发酵时间过长、下游分离难度大、设备成本高。提取法就是从茶叶组织中直接提取，由于茶氨酸在茶叶中含量很低，因而提取法并不适于大量制备。近年来，由于L-茶氨酸的生理功能不断被发现，L-茶氨酸的应用研究受到越来越多的重视。目前，L-茶氨酸已在日本和欧洲被正式批准为食品添加剂，并广泛应用；L-茶氨酸在药品中的应用也在开发之中。随着L-茶氨酸的市场需求日益扩大，有关其合成技术的研究也受到广泛的关注。专利W02004016798公开了一种酶法合成茶氨酸的方法。该方法从自然界土壤中分离选定香茅醇假单胞菌GEA作为具有Y -谷氨酰基转移活性的茶氨酸生产菌，在PH为 9 12的条件下，以L-谷氨酰胺和乙胺为底物，将来自该菌的谷氨酰胺酶用于催化制备茶氨酸。专利W02006001296在前述专利方法上做了扩展改进，使用来自芽孢杆菌属、霉菌或酵母中的一种或两种以上的来自微生物的谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺和乙胺衍生物反应，生成L-茶氨酸。该方法主要考察了不同菌种、不同活性的酶对反应进行催化。但是上述酶法均以L-谷氨酰胺为底物，存在自转肽问题，即由于L-谷氨酰胺具有α -氨基，在实际反应中也可作为Y-谷氨酰受体，形成谷氨酰谷氨酰胺(Glu-Gln)。专利200810024835. 5公开了以L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为酰基供体，乙胺盐酸盐为受体，在水相中实现了茶氨酸的高效合成。该方法保护了 L-谷氨酰胺的α-氨基， 可有效抑制自转肽反应和底物消旋化，供体转化率高；同时，由于形成的产物-茶氨酸-铜 (II)溶解度较低，可通过直接浓缩、结晶进行分离纯化，简化了下游过程。但是铜作为一种重金属元素，具有一定的毒性，铜离子能够使人体的蛋白质的结构发生不可逆的改变，蛋白质的结构改变功能就会丧失，导致体内的酶就不能够催化化学反应，细胞膜表面的载体就不能运入营养物质、排出代谢废物，肌球蛋白和肌动蛋白就无法完成肌肉收缩，所以体内细胞就无法获得营养，排除废物，无法产生能量，细胞结构崩溃和功能丧失。在食品国家标准中铜的最高限量为10mg/kg左右，远远低于锌，钙，镁的最高限量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法合成L-茶氨酸的方法，以避免自转肽副反应，同时简化茶氨酸的合成工艺。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下一种酶法合成L-茶氨酸的方法，该方法包括如下步骤(1)利用化学法分别制成含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液，调反应液 pH 至 8. 0 11. 0，所述的金属离子为 Si (II)、Ca(II)、Mg(II) ^Fe(II)；(2)向上述含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液中加入乙胺水溶液和 Y-谷氨酰转肽酶，使得反应体系中，L-谷氨酰胺的起始浓度为10 30mmol/L，乙胺的起始浓度为50 500mmol/L，γ -谷氨酰转肽酶的加入量为0. 2 0. 5U/mL,反应pH为8. 0 11. 0，反应温度为35 45°C，反应时间为2 5小时，得L-茶氨酸-金属离子配合物；(3)在反应液中加入盐酸使L-茶氨酸-金属离子配合物解离出茶氨酸；(4)将所得茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。步骤(1)中，化学法合成L-谷氨酰胺-二价金属离子配合物是本领域技术人员已知技术。底物L-谷氨酰胺通过金属配位，保护了 L-谷氨酰胺上的α-氨基和α-羧基，解决了 L-谷氨酰胺的自转肽问题，从而提高转化率。步骤(1)中，用浓度为10 20g/L的NaOH来调节反应液的pH值。步骤O)中，反应受体乙胺的比例高，有利于供体转化率的提高。其反应方程式如下
权利要求
1.一种酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)利用化学法分别制成含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液，调反应液PH至 8.0 11. 0，所述的金属离子为 Si (II)、Ca(II)、Mg(II) ^Fe(II)；(2)向上述含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液中加入乙胺水溶液和γ-谷氨酰转肽酶，使得反应体系中，L-谷氨酰胺的起始浓度为10 30mmol/L，乙胺的起始浓度为 50 500mmol/L，γ -谷氨酰转肽酶的加入量为0. 2 0. 7U/mL,反应pH为8. 0 11. 0，反应温度为35 45°C，反应时间为2 5小时，得L-茶氨酸-金属离子配合物；(3)在反应液中加入盐酸使L-茶氨酸-金属离子配合物解离出L-茶氨酸；(4)将所得L-茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。
2.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(1)中，用浓度为10 20g/L的NaOH来调节反应液的pH值。
3.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸方法，其特征在于步骤( 中，所述Y-谷氨酰转肽酶的纯度大于95%。
4.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(3)中，加入体积为反应液体积6 10%的lmol/L盐酸。
5.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中，利用乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种以L-谷氨酰胺的二价金属离子配合物为供体，酶法制备L-茶氨酸的方法，包括利用化学法合成L-谷氨酰胺的二价金属离子配合物，这些金属离子包括Zn(II)、Ca(II)、Mg(II)、Fe(II)；将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺二价金属离子配合物和乙胺的混合水溶液中反应。利用本方法可有效避免自转肽问题，大大提高对供体的转化率，工艺简单，条件温和，成本低，适合茶氨酸生产的实际应用。
文档编号C12P13/04GK102181501SQ20111006630
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者姚忠, 徐虹, 王浩琦, 胡国梅, 韦萍 申请人:南京工业大学