专利名称：野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种基因的的克隆方法，特别涉及野葛葡糖基转移酶基因朽游7￥的克隆方法。
背景技术：
野葛(A/eraria lobata (ffilld. ) Ohwi )是豆科植物葛属，其根作为中国传统中药已有相当长的历史。葛根味甘，性辛凉，归脾、胃经。具有升阳、活血、通络的作用，其有效药用成分是异黄酮类化合物葛根素、大豆甙、大豆甙元等。其中葛根素含量高、药性好，可显著改善冠心病患者心肌供血，治疗不稳定性心绞痛、室性期前收缩；降低血糖、血脂、抗氧化、增加血液流动性，降低肺动脉高压，治疗糖尿病性周围神经病变以及改善胰岛素抵抗等作用(Song et al.，1988 ；Xu et al. , 2005 ；黄筑艳等，2007)。 对野葛生物合成葛根素的途径，尤其是调节酶的研究一直得到关注，已从野葛克隆了查尔酮合酶基因(Nakajima et al.，1996 ；Yamaguchi et al.，1999)，克隆的查尔酮-异黄酮异构酶在大肠杆菌表达 (Terai et al. , 1996)，野葛查尔酮还原酶基因在烟草中表达(Joung et al.，2003)。上述野葛合成代谢相关基因的表达与葛根素生产间的相关性研究尚未有报道。目前认为，葛根素的生物合成是异甘草素在葡糖基转移酶作用下，C8位通过C-C连接一个葡萄糖基形成 C-葡糖基查尔酮中间体，接着自身脱水形成葛根素，其C-糖基化发生在查尔酮阶段。已知模式植物拟南芥、水稻中有催化几种连接键混合的葡糖基转移酶，但缺乏单独催化C-葡糖基转移酶的氨基酸序列，无法调出C-葡糖基转移酶的CDNA和氨基酸序列，因此，从野葛中克隆糖基转移酶并研究其功能，为认识调节植物体内葛根素生物合成途径和调控研究提供依据，为微生物工程大规模生产葛根素提供基础，在理论和应用方面具有重要意义。 已经报道指出，不同种属的生物、同一生物个体的不同组织、同一组织的不同发育阶段、甚至同一细胞株的不同时相，其糖基转移酶的表达也有差别(Bettina et al.，2005)，例如苜薯具有一系列糖基转移酶的基因序列以及这些糖基转移酶绝大部分参与了类黄酮代谢，科学家将参与次级代谢的糖基转移酶的保守序列称为PSPG框(Hughes and Hughes, 1994)。 PSPG框由靠近蛋白C端大约40个氨基酸组成，保守性很强，达到60%-80%，在进化上也作为一个筛选糖基转移酶的基因的标志(Gachon et al.，2005)。现阶段，普遍利用同源基因克隆及RACE技术克隆糖基转移酶基因，但是如果引物设计不当，反应条件控制不好，根本无法克隆出完整的目的的。野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4是新发现的一种糖基转移酶基因，其Genebank登陆号为EU889122，全长1590bp，其序列如SEQ ID NO. 9所示，其蛋白序列如SEQ ID NO. 10 所示。该基因可广泛应用于野葛品质的改良，尤其是野葛作为药用植物的开发和利用等领域。但是目前缺乏有效的克隆方法。
发明内容
本发明的目的在于提供野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的克隆方法。
本发明所采取的技术方案是
野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的克隆方法，包括以下步骤
1)提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；
2)以cDNA 为模板，以简并引物 UGTD-F TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3' (SEQ ID NO. 1)和 UGTD-R 5‘ TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3' (SEQ ID NO. 2)为引物，进行温度梯度PCR，得到cDNA，其反应条件为94°C预变性5 min，94°C变性30s，54°C 63°C 30s ，72°C延伸30s, 20 40个循环，最后72°C延伸lOmin，得到中间序列；
3)以步骤1)得到的总 RNA 为模板，3' RACE T 5' GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTT TTTTTTT 3' (SEQ ID NO. 3)为引物反转录得到 cDNA ；
4)以上一步骤得到的cDNA为模板，巢式PCR得到野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的3' 末端序歹丨J ；
5)以步骤1)得到的总RNA为模板，采用TaKaRa公司5'-Full RACE Kit获得野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的5'末端序列；
6)将中间序列、3'末端序列、5' 末端序列用SeqMan拼接得到P1UGT4的cDNA序列，根据拼接得到 P1UGT4 的 cDNA 序列设计引物 P1UGT4F :ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG (SEQ ID NO. 4)和 P1UGT4R :TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC (SEQ ID NO. 5)，以步骤 1)得到的cDNA为模板，PCR得到野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的开放阅读框(ORF)蛋白cDNA序列。优选的，步骤4)中，PCR 的引物为 P1UGT4-F1 :ACCATCATGGAAAGTGTGAACGC (SEQ ID Ν0· 6)、P1UGT4-F2 :AGAATGGAGACCGTGGAACGACTTTGG (SEQ ID NO. 7)和 3 ' RACE R: GACTCGAGTCGACATCGA (SEQ ID NO. 8)。本发明的方法，可以有效地克隆出野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实施例中，使用的简并引物为
UGTD-F 5' TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3' (SEQ ID NO. 1) UGTD-R 5' TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3' (SEQ ID N0. 2)。实施例1
1)提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；
2)以上一步骤得到的cDNA为模板，使用简并引物UGTD-F和UGTD-R进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，54°C 30s，72°C延伸30s，20个循环，然后72°C 延伸lOmin，扩增得到150 bp泳带；
3)取总RNA2 Pg为模板，以walking法设计的引物为引物，反转录得到cDNA;
4)以反转录得到cDNA为模板，通过walking方法设计的为引物反转录得到cDNA，PCR 扩增，无法得到野葛葡糖基转移酶基因的末端。实施例2
1)提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；
2)以上一步骤得到的cDNA为模板，使用简并引物UGTD-F和UGTD-R进行PCR扩增，反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C 30s，72°C延伸30s，40个循环，然后72°C 延伸lOmin，无法扩增出RNA泳带。实施例3
1)提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；
2)以上一步骤得到的cDNA为模板，使用简并引物UGTD-F和UGTD-R进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s, 57°C 30s，72°C延伸30s，30个循环，然后72°C 延伸lOmin，扩增得到250 bp泳带，称为中间序列；
3)取总RNA2 Pg为模板，以RACE-T法设计的反转录引物5' GACTCGAGTCGACATCGAT TTTTTTTTTTTTTTTT 3, (SEQ ID NO. 3)为引物，superscript III 反转录酶(Invitrogen) 反转录得到cDNA ；
4)以上一步骤中反转录得到cDNA为模板，引物P1UGT4-F1:ACCATCATGGAAAGTGTGAACGC (SEQ ID NO. 6)和 3 ‘ RACE R: GACTCGAGTCGACATCGA (SEQ ID NO. 8)进行第一轮PCR扩增得到cDNA产物；以第一轮PCR的cDNA产物为模板，P1UGT4-F2 AGAATGGAGACCGTGGAACGACTTTGGCSEQ ID N0. 7)和 3' RACE R: GACTCGAGTCGACATCGACSEQ ID NO. 8)为引物进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物，PCR程序为94°C预变性5min,94°C 变性 30s，55°C 30s，72°C延伸 lmin，30 个循环，然后 72°C延伸 IOmin ；
5)对PCR产物进行测序，证明得到的PCR产物为野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的3' 末端序歹丨J ；
6)以总RNA为模板，采用TaKaRa公司5'-Full RACE Kit获得野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的5'末端序列；
7)用S印Man将中间序列、3‘ 末端序列和5 ‘ 末端序列拼接，得到P1UGT4的cDNA 序列，并根据得到 P1UGT4 的 cDNA 序列设计引物 P1UGT4F :ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG (SEQ ID Ν0· 4)和 P1UGT4R: TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC (SEQ ID NO. 5)，以步骤 1)得到的cDNA为模板，PCR得到野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的开放阅读框(ORF)蛋白cDNA 序列。对PCR产物测序，证明得到的序列为P1UGT4的ORF蛋白cDNA序列。实施例4
1)提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；
2)以上一步骤得到的cDNA为模板，使用简并引物UGTD-F和UGTD-R进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s, 63°C 30s，72°C延伸30s，30个循环，然后72°C 延伸lOmin，扩增得到200 bp泳带；
3)以总RNA2 Pg为模板，以walking法设计的引物为引物，反转录得到cDNA;
4)以反转录得到cDNA为模板，PCR扩增不能获得野葛葡糖基转移酶基因的末端。
权利要求
1.野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的克隆方法，包括以下步骤1)提取野葛的总RNA，反转录得到CDNA；2)以cDNA 为模板，以简并引物 UGTD-F TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3' (SEQ ID NO. 1)和 UGTD-R 5‘ TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3' (SEQ ID NO. 2)为引物，进行温度梯度PCR，得到cDNA，其反应条件为94°C预变性5 min，94°C变性30s，54°C 63°C 30s ，72°C延伸30s, 20 40个循环，最后72°C延伸lOmin，得到中间序列；3)以步骤1)得到的总 RNA 为模板，3' RACE T 5' GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTT TTTTTTTTT 3' (SEQ ID NO. 3)为引物反转录得到 cDNA ；4)以上一步骤得到的cDNA为模板，巢式PCR得到野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的 3'末端序列；5)以步骤1)得到的总RNA为模板，采用TaKaRa公司5' -Full RACE Kit获得野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的5'末端序列；6)将中间序列、3'末端序列、5'末端序列用SeqMan拼接得到P1UGT4的cDNA序列，根据拼接得到 P1UGT4 的 cDNA 序列设计引物 P1UGT4F :ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG (SEQ ID NO. 4)和 P1UGT4R :TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC (SEQ ID NO. 5)，以步骤 1)得到的cDNA为模板，PCR得到野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的开放阅读框(ORF)蛋白cDNA序列。
2.根据权利要求1所述的野葛葡糖基转移酶基因P1UGT4的克隆方法，其特征在于步骤 4)中，PCR 的引物为 P1UGT4-F1 :ACCATCATGGAAAGTGTGAACGC (SEQ ID NO. 6)、P1UGT4_F2 AGAATGGAGACCGTGGAACGACTTTGG (SEQ ID NO. 7)和 3' RACE R: GACTCGAGTCGACATCGACSEQ ID NO. 8)。
全文摘要
本发明采用同源基因克隆法结合RACE方法设计逆转录引物，从野葛根中克隆得到了野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4。本发明的野葛葡糖基转移酶基因的核苷酸序列及其编码的蛋白序列以及基因克隆方法，可广泛应用于野葛品质的改良，尤其是野葛作为药用植物的开发和利用等领域。
文档编号C12N15/10GK102181432SQ20111006629
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者周文灵, 李玲 申请人:华南师范大学