专利名称：一种可应用于油气勘探的有效的微生物检测方法
技术领域：
本发明专利属于生物技术领域，涉及一种可应用于微生物油气勘探，并可有效避免生物产甲烷影响的甲烷氧化菌含量异常检测方法。
背景技术：
经过多年的三维地震、地震地层学勘探，大批易于发现的油气藏资源已经完全开发，规模相对较小、非构造型和隐蔽的油气藏资源成为勘探的主要对象。但随之而来的是勘探成本的大幅度增高。因此，建立一套廉价而有效的勘探技术体系迫在眉睫。在现代勘探方法中，微生物油气勘探能为初期勘探提供廉价有效的帮助，指示和预测有利勘探区块，以降低勘探风险。微生物油气勘探是地表勘探方法的一个分支，主要建立在地表轻烃泄漏的基础上。在地壳压力的驱动下，油气藏中的轻烃类气体(主要为甲烷，此外还包括其他各种气态或易挥发类轻烃)持续的向地表扩散和运移，在地表形成轻烃异常区域。土壤中的专 性微生物以该类轻烃作为唯一碳源和(或)能源，从而在油气藏地表土壤中非正常发育并形成微生物异常。通过检测这些特定种类的微生物异常，并与背景区域检测结果进行比对，可以间接反映某一地区油气藏资源的存在。至今为止，微生物油气藏勘探技术仍然建立在直接培养法的基础上，利用特定的培养基对土壤中的指示性微生物进行培养，通过检测微生物数量以及代谢活性反映微生物异常，主要涉及的指示性微生物种类包括甲烷氧化菌、乙烷氧化菌、丙烷氧化菌和丁烷氧化菌等，如专利WO 90/02816,US 5093236所述。而土壤中的绝大多数(99.7%)微生物都是不可培养的[Amann et al. Microbiological Reviews, 1995, 59 (I) : 143-169.],直接培养法会大大影响微生物异常的检测准确度。Real-time PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，能够准确量化环境功能基因，可以有效的解决直接培养法所遇到的定量难题。专利CN 101815794A(GB 2451287A)利用Real-time PCR对特定的指示性微生物功能基因进行定量，进而实现更为快捷、高效、准确的微生物油气勘探。但同时该专利也提及，虽然迁移到表面的气体的主要化学成分为甲烷，但甲烷可以是地理产生也可以是生物产生，以甲烷氧化菌为指示菌的情况下存在“假阳性”结果的风险。但油气资源上溢轻烃的主要成分为甲烷(95%)，其中的乙烷、丙烷、丁烷含量极少(3%)[金文标等.天然气工业，2002，22 (5) :20-22.]，所造成的乙烷、丙烷、丁烷氧化菌异常较弱，不易检测。因此，本专利的创新点即在于以甲烷氧化菌为油气资源指示菌，并提出一种可有效避免“假阳性”结果的检测方法，消除生物产甲烷影响，最终给出有效、合理的勘探结果。目前，针对甲烷氧化菌的定量研究已经取得了很大的成果。Kole等[Kolb etal. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69 (5) :2423-2429.]借助 Real-timePCR技术，利用pmoA功能基因对土壤中的甲烷氧化菌含量进行了定量研究，并获得了很好的检测结果。pmoA基因负责编码颗粒状甲烷单加氧酶的a亚基，是甲烷单加氧酶的重要组成成分，存在于除methylocella以外的所有已知的甲烷氧化菌中，因此被广泛的运用于环境样品中甲烷氧化菌的检测与定量。此外，在针对生物产甲烷的研究中，Nunoura等[Nunoura et al. Fems Microbiology Ecology, 2008,64 (2) :240_247.]利用 mcrA 基因对产甲烷菌进行了定量。mcrA基因负责编码甲基辅酶M还原酶a亚基。甲基辅酶M还原酶是甲烷产生过程的关键酶，并在产甲烷菌中普遍存在。本发明中针对mcrA的定量主要是为了消除潜在的生物产甲烷对甲烷氧化菌定量的影响。
发明内容
针对目前微生物油气勘探中以甲烷氧化菌为指示菌时存在“假阳性”结果的风险，即无法区分甲烷来源为生物产甲烷或地理产甲烷，本发明提供了一种新的可消除生物产甲烷影响的甲烷氧化菌含量异常检测方法。本发明所使用的取样深度涉及60cm至200cm，较好的为60cm。本发明所使用的方法为通过Real-time PCR技术对土壤样品中的甲烷氧化菌和产甲烷菌分别定量，比对不同区域间的甲烷氧化菌含量，确定出甲烷氧化菌异常区域。随后通过甲烷氧化菌与产甲烷菌的比值，进一步分析甲烷氧化菌异常的原因是否为生物产甲烷。 若某一区域具有较高的甲烷氧化菌含量，但甲烷氧化菌与产甲烷菌比值相对于其他区域较低，则该处高甲烷氧化菌含量形成的原因可能为生物产甲烷。只有当某一区域相对于其他区域同时具有较高的甲烷氧化菌含量和较高的甲烷氧化菌与产甲烷菌比值时，才可断定该处高甲烷氧化菌含量形成的原因并非生物产甲烷，从而消除生物产甲烷的影响，减少“假阳性”结果的风险。本发明以微生物分子生物学以及微生物油气勘探技术为理论依据，针对油气藏泄漏气体主要成分为甲烷的特性，设计甲烷氧化菌为指示菌，同时消除了生物产甲烷的影响，可以更为准确的进行微生物油气勘探。本发明具有以下优点①采用分子生物学技术，可有效避免直接培养法的缺点，解决绝大多数微生物不可培养的难题可以更为快速高效的获取勘探结果，同时也增加了定量结果的准确性；③消除了生物产甲烷的影响，减少“假阳性”结果的风险。
具体实施例方式以下通过具体实施例阐述本发明，目的在于帮助读者更好地理解本发明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
具体实施方式
如下实施例I :取样区域为胜利油田某一未开发小型气田。取样点包括气田中心、气田边界以及两个空白对照，分别定义为A、B、C、D点。取样深度为60cm。各取样点间距约为750m。土壤样品获取后置于冰上，快速转移至实验室并保存于_20°C。实施例2 :利用 FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, LLC, USA)提取土壤 DNA。实施例3 :利用 Mx3005P QPCR Systems (Stratagene)进行 Real-time PCR。所用试剂为SYBR. Premix Ex Taq (Fermentas)。在利用pmoA基因实现对甲烧氧化菌的定量过程中，所采用的引物为A189f (5' -GGNGACTGGGACTTCT GG-3')和mbeeiRC -CCGGMGCAACGTCYTTACC-3')。以 uncultured bacterium clone M_5 pmoA gene (GQ906777)为标准品构建标准曲线。Real-time PCR所用程序为95°C lOmin，随后95°C变性20s，57°C退火30s，72°C延伸35s，重复该循环40次，并在退火阶段末端收集信号。利用mcrA基因对产甲烷菌进行定量时，所采用的引物为 ME3MF(5' -ATGTCNGGTGGHGTMGGSTTYAC-3')和ME2r(5' -TCATBGCRTAGTTDGGRTAGT-3')。以uncultured archaeon clone Ace-28 mcrAgene(EU275997)为标准品构建标准曲线。Real-time PCR所用程序为95°C lOmin，随后95°C变性20s，52°C退火30s，72°C延伸35s，重复该循环40次，并在退火末端收集信号。实施例4 :利用MxPro QPCR Software (version 4. I)分析定量结果。在A气田中心，pmoA含量达到I. 55X 105copies/g(拷贝数每克土壤)，B气田边界为I. 32X IO5Copies/g，而C空白对照I为2. 36X 104copies/g，D空白对照2仅为8. 00X 102copies/g。在这种情况下，D点甲烷氧化菌含量很低，可以排除进一步勘探的价值。A、B、C同时具有较高的甲烷氧化菌含量，随后计算pmoA/mcrA值(甲烷氧化菌与产甲烷菌比值)，四个点分别为6. 40、
5.33,0. 09,0. 01。C点虽然具有较高的甲烷氧化菌含量，但其pmoA/mcrA值仅为0. 09，远低于邻近的A、B点，表明该处高甲烷氧化菌含量形成的原因可能为生物产甲烷，其阳性结果属于“假阳性”，同样可以排除进一步勘探的价值。A、B同时具有较高的甲烷氧化菌含量以及pmoA/mcrA值，可以断定该区域高甲烷氧化菌含量形成的原因并非生物产甲烷，该区域存在着轻烃泄漏，其地下可能存在着油气资源，有必要针对A、B点进行进一步的勘探。 空白对照I同样含有较高的甲烷氧化菌含量，容易造成假阳性结果。随后计算pmoA/mcrA值(甲烷氧化菌与产甲烷菌比值)，四个点分别为6. 40、5. 33、0. 09、0. 01。气田中心及边界同时具有较高的甲烷氧化菌含量以及pmoA/mcrA值，可以断定该区域高甲烷氧化菌含量形成的原因并非生物产甲烷，这与该区域的气田特性相吻合。而空白对照I虽然具有较高的甲烷氧化菌含量，但其pmoA/mcrA值仅为0. 09，远低于邻近的气田和气边界，表明该处高甲烷氧化菌含量形成的原因可能为生物产甲烷，从而避免了假阳性结果。空白对照2则表现正常，地底并无任何油气资源，甲烷氧化菌含量与pmoA/mcrA值都很低。实施例5 :通过实施例4的分析可断定，A、B属于微生物油气勘探的阳性区域，地下可能存在着油气资源，具有进一步的勘探价值。而C点的甲烷氧化菌异常为“假阳性”，D点并不具有甲烷氧化菌异常，从微生物勘探的角度，两者可以排除进一步的勘探的必要性。实施例6 :依据前期的可靠勘探结果，A、B、C、D四点分别为气田中心、气田边界以及两个空白对照。这与本专利采用微生物勘探技术所得结论一致。
权利要求
1.一种可应用于油气勘探的有效的微生物检测方法，其特征在于利用Real-time PCR技术，对油气田地表特定深度的甲烷氧化菌和产甲烷菌进行定量，参考甲烷氧化菌与产甲烷菌的比值指标，给出有效、合理的勘探结果。
2.权利要求I所述地表特定深度，其特征在于涉及60cm至200cm,较好的为60cm深度。
3.权利要求I所述检测方法，其特征在于以甲烷氧化菌为油气资源指示菌，利用Real-timePCR技术，可以有效的解决绝大部分甲烷氧化菌不可直接培养的难题，使定量结果更为准确客观。
4.权利要求I所述检测方法，其特征在于参考甲烷氧化菌与产甲烷菌的比值指标，可避免生物产甲烷影响，减少“假阳性”结果的风险。
5.权利要求4所述参考甲烷氧化菌与产甲烷菌的比值指标减少“假阳性”结果风险，其特征在于只有当某一区域相对于其他区域同时具有较高的甲烷氧化菌含量和较高的甲烷氧化菌与产甲烷菌比值时，才可断定该处具有非生物原因的甲烷氧化菌含量异常，为微生物勘探的阳性区域。若某一区域具有较高的甲烷氧化菌含量，但甲烷氧化菌与产甲烷菌比值相对于其他区域较低，则该处高甲烷氧化菌含量形成的原因可能为生物产甲烷，为“假阳性”区域。
全文摘要
一种可应用于油气勘探的有效的微生物检测方法。本发明专利属于生物技术领域，涉及一种可应用于微生物油气勘探，以甲烷氧化菌为指示菌，并可有效避免生物产甲烷影响的甲烷氧化菌含量异常检测方法。本发明通过Real-time PCR技术对土壤样品中的甲烷氧化菌和产甲烷菌分别定量，比对不同区域间的甲烷氧化菌含量以及甲烷氧化菌与产甲烷菌的比值，进一步推断甲烷氧化菌异常的原因是否为生物产甲烷，从而消除生物产甲烷的影响，减少“假阳性”结果的风险。本发明可应用于微生物油气勘探，为初期勘探提供廉价有效的帮助，指示和预测有利勘探区块，以降低勘探风险和成本。
文档编号C12Q1/64GK102676643SQ20111006576
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者呼庆, 庄国强, 满鹏, 白志辉, 马安周, 齐鸿雁 申请人:中国科学院生态环境研究中心