专利名称：一种新型重组葡激酶及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域。
天然葡激酶(Staphylokinase，Sak)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白水解酶，由136个氨基酸组成。Sak本身并不是酶，它在人血浆中与纤溶酶原(plasminogen，plg)形成1∶1复合物，该复合物被血块表面痕量的纤溶酶(plasmin，plm)激活为Sak·plm，Sak·plm是高效的纤溶酶原激活剂，激活游离的plg形成plm，催化血栓主要基质纤维蛋白降解，从而溶解血栓。由于Sak激活plg具有纤维蛋白专一性，而且对陈旧性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比其他溶栓药物更强，因此Sak是一种高效特异的溶栓剂(Collen D at al.Nature Medicine.4.279-284(1998))。目前，国内外有数家公司生产重组葡激酶，但在基因结构上有所不同。比利时Collen D.等研究的重组葡激酶已进行急性心肌梗塞(AMI)溶栓治疗的临床II期试验，我国成都世新中心也完成了AMI溶栓治疗的I期临床试验，效果良好。上海医科大学于1994年自行构建了Sak基因，实现了在大肠杆菌中的高效表达，并完成了中试研究，已申报临床试用，即将试用于治疗急性脑梗塞。但是，Sak是异体蛋白，用于人体有较强的抗原性，虽然临床试用中还未发现有严重过敏反应，然而大部分病人用药二周后，出现高滴度的中和抗体，阻碍了Sak的重复使用(Declerck PJ et al.ThrombHaemost.71.129-133(1994))。而且，在重组葡激酶的研究过程中发现，葡激酶易形成二聚体、甚至多聚体。聚合体的形成导致Sak免疫原性的增强。
在利用溶栓药物进行溶栓治疗的同时，通常联合应用肝素、阿斯匹林等抗凝血酶、抗血小板药物，以促进溶栓，并防止再梗塞。近年来，溶栓辅助药的研究引人注目。Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)序列是对抗血小板聚集的功能序列，可竞争结合血小板膜凝聚有关的糖蛋白膜受体IIb/IIIa，从而阻止纤维蛋白原与受体结合，阻断血栓再形成(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Nichols AJ et al.Trends Pharmacol Sci.13.413-417.(1992))。在一定构象限制下，将RGD/KGD序列导入溶栓药物，如尿激酶cDNA基因的一定部位，其表达产物具有溶栓、防栓的双重功能(Smith J et al.J Biol Chem.270.30486-30490.(1995))。基于RGD/KGD序列，还发展了许多化学模拟物，如Tirofiban，Lamifiban，Lefradafiban，Orbofiban，Xemilofiban，Integrilin等，亦可封闭IIb/IIIa受体，与溶栓药物合用，再梗塞发生率显著降低(Frishman WH et al.Am Heart J.130.877-892.(1995)；Verstraete M et al.49.856-884.(1995))。
本发明的目的是提供一种防止二聚体形成并具有防栓、溶栓双重功能的新型葡激酶蛋白质结构及其制备方法。本发明应用结构生物学设计新型Sak分子结构，并利用基因工程手段生产，所得产品除了具有高效、特异的溶栓功能外，尚具有低聚合性能和抗血小板聚集等新特性，并且制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性均与野生型Sak基本相同。
本发明采用下述技术方案(1)Sak是一椭球状分子，从第21个氨基酸残基起，分别由五条、两条β折叠股构成的β折叠片包裹在一个由12个残基构成的α螺旋上，而N端20个氨基酸伸向球体外，非常柔韧，其功能难以从晶体结构推测。Sak呈明显的亲疏水性的不对称性，且活性区主要在亲水一侧(Zhan CH etal.
Acta Crys t.D52.564-565.(1996)；Rabi jns A et al.Nat.
Struct.Biol.5.(1997))。根据上述r-Sak精确的三维结构模型，通过计算机分子对接手段，预测了r-Sak二聚体可能的结合方式，建立二聚体的三维结构模型。二聚体主要通过疏水相互作用与氢键结合，且结合界面在非活性一侧。
(2)由此设计了突变体RGD/KGD-Sak的分子结构，并利用PCR
定点突变技术改变野生型Sak基因碱基序列，使其含有RGD/KGD编码序列。即以质粒pST-Sak为模板，上游引物、突变引物、下游引物进行三轮PCR扩增，获得RGD/KGD-Sak基因，然后与质粒pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变。
(3)突变体RGD/KGD-Sak基因与原核表达载体pLY-4重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，温度诱导RGD/KGD-Sak基因表达。表达产物以包涵体的形式存在于工程菌内。
(4)发酵技术用低营养培养基M9CA培养工程菌，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等进行补料，发酵参数为温度30-42℃，氧容量为50％-80％，pH＝6-8，搅拌速度随DO升高而降低；(5)工程菌发酵后用高压破碎，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，尿素溶解，稀释复性，然后用凝胶过滤和离子交换二步法纯化产品。
(6)与野生型Sak性质比较表明，突变体RGD-Sak纤溶活性与野生型相似，形成聚合体的能力明显降低，并且能显著抑制ADP诱导的血小板的聚集，具有溶栓、防栓双重功能。
实施例1.r-Sak半成品的鉴定Sak半成品由上海医科大学提供(970923)，原纯度达98％以上，-70℃保存。
还原性、非还原性SDS-PAGE—按Laemmli方法进行。
样品溶解液含0.0625M Tris-HCl(pH6.7)，2％SDS，10％甘油，5％巯基乙醇，0.001％溴酚兰。
样品处理和点样取半成品1瓶(3mg/瓶，-70℃保存3月以上)，溶于3ml双蒸水中，点样量为10μl。
凝胶染色考马斯亮兰或银染色。
凝胶中蛋白质带扫描以Pharmacia公司的ImageMasterRVDS进行扫描，并用所附软件分析各蛋白质条带含量。
电泳结束后，以考马斯亮兰染色，在相对分子量约15.5KD、31KD、46KD、62KD处出现浓集的条带。
翻转酪蛋白凝胶板法测定活性—上述凝胶依次用2.5％TritonX-100溶液和蒸馏水充分洗涤，覆盖于含纤维蛋白原、人纤溶酶原及凝血酶的琼脂凝胶板上，37℃保温8h后，在上述分子量相应位置均有清亮的透明溶解带。表明r-Sak半成品储存过程中有形成聚合体的倾向，且聚合物非常稳定，并保持一定活性。2.葡激酶二聚体的分子模拟及突变体的合理设计分子对接软件是美国Rockefeller大学Vakser IA开发的GRAMMV1.03，在SGI 02图形工作站上进行模建工作。
为了确定Sak二聚体的结合区，在Sak单体X射线衍射晶体结构基础上，以GRAMM V1.03软件进行分子对接，选择一分子Sak为受体，另一分子Sak为配体，以Sak受体搜索与配体Sak的结合区。按作者推荐的整体高分辨率对接参数进行对接(表1)，搜索了10个复合物的结构。
表1整体高分辨率对接参数Table 1 The parameters for high-resolution generic dockingMatching mode(generic/helix)...........................mmode＝genericGridstep...........................................................eta＝1.7Repulsion(attraction is always-1)......................ro＝30Attraction double range(fraction of single range)...fr＝0Potential range type(atom radius，grid step).....crang＝atom radiusProjection(blackwhite.gray)..........................ccti＝grayRepresention(all，hydrophobic).......................crep＝allNumber of matches to output.............................maxm＝10Angle for rotations，deg(10，12，15，18，20，30，0-no rot)ai＝10静电势及疏水性分析表明，Sak单体呈明显的亲疏水性的不对称性。Silence等通过随机突变的研究表明，决定活性的氨基酸主要位于亲水一侧(Silence K et al.J Biol Chem.270.27192-27198.(1995))。Sak的疏水面有两个主要的疏水区(HydrophobicRegion，HR)，分别位于47-56(HR1)，104-113(HR2)位残基处，其中的HR2疏水性更强。在模建的二聚体结构模型中，疏水区相互作用显示重要作用，并有HR1-HR2、HR2-HR2两种结合方式。由于HR1靠近活性区，因此若两分子Sak通过HR1-HR2结合，则一分子Sak的活性区将被遮蔽，可能仅保留一分子Sak的活性若以HR2-HR2的方式结合，活性似乎不会受到很大影响。
蛋白质相互作用的界面通常有600-1300A-2，每个蛋白质提供10-30个接触残基，但是，界面中存在所谓“热点区”，仅3-5个氨基酸就提供了80％左右的结合能，改变这些残基，复合物的结合能力将显著下降(Li B et al，Science.270.1657-1660.(1995))。因此，二聚体无论以何种方式结合，只要改变HR2的主要结合残基，就可能阻止二聚体的形成。Phe111位于HR2的核心区，是强疏水性氨基酸，且远离活性区，本发明将其替换为强极性氨基酸Asp，以破坏疏水作用，并期望能保持活性。同时，鉴于RGD/KGD序列肽可抑制血小板聚集，而正好位于β-折叠的loop区，构象比较自由，因此本发明将Lys109改变为Arg或保持不变，形成RGD/KGD序列。3.RGD/KGD-Sak基因的克隆及原核表达质粒的构建质粒pST-SAK为模板，以上游引物、突变引物进行第一轮扩增，351bp扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，与下游引物再次以质粒pST-Sak为模板进行第二轮扩增。纯化后，所得408bp片段为模板，以上游引物、下游引物进行第三轮扩增，产物经Klenow酶补平，EcoRI、BamHI酶解后与pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实已发生设计的突变，由基康生物技术公司用ABI377测序仪完成序列分析。然后用EcoRI、BamHI将RGD/KGD-Sak基因切出，连入表达载体的相应位点。
上游引物5’...CGC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC...3’下游引物5’...CGC GGA TCC TTA TTT CTT TTC...3’突变引物5’...TAA ATC TGG GAC GAC GTC ACC ACG TTC TGT
TAT AGG...3’引入PstI位点以便于筛选寡核苷酸由美国Johns Hopkins大学DNA合成组制备。
目的基因与表达载体重组，转化大肠杆菌JF1125，提取质粒，以相应酶酶解鉴定，获得特征性片段，证实获得阳性克隆。
表达质粒转化大肠杆菌JF1125，经温度诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物。电泳结束后，一半进行考马斯亮兰染色，可见诱导后细菌裂解液在分子量约15.5KD处有一浓集的条带，经扫描，重组蛋白约占全菌总蛋白的50％；另一半洗去SDS后，贴在酪蛋白凝胶板上，37℃孵育数小时后，相当于15.5KD处有一明显的透亮区，即此部位的酪蛋白已溶解，表明RGD/KGD-Sak具有纤溶活性。菌体经压榨离心后，15.5KD条带主要位于沉淀中，而上清中几乎未见此条带，说明表达产物以包涵体形式存在。4.工程菌的诱导表达筛选高表达菌株作为工程菌，然后以10L发酵罐进行低密度发酵，温度诱导后，离心收集菌体，PBS洗涤后，-70℃保存待用。10L发酵液得湿菌80g。湿菌用PB缓冲液悬浮，以高压匀浆泵压榨，离心后，SDS-PAGE结果表明，目的蛋白存在于沉淀溶解物行内，于分子量15.5Kda处染色很深，而上清液行内相同部位几乎未见染色，表明RGD/KGD-Sak主要以包涵体形式存在。5.包涵体的分离、溶解与复性80g压榨破菌，离心，得包涵体20g。包涵体经洗涤，离心后，以8M尿素溶解，室温作用至澄清透明。超离后弃沉淀，取上清稀释复性。6.Sephadex G-10及S-Sepharose FF柱层析超滤浓缩后，先以Sephadex G-10凝胶过滤，然后以10倍柱体积PB缓冲液平衡S-Sepharose FF色谱柱，凝胶过滤后溶液直接上柱，Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰。上样结束后，以PB缓冲液洗至基线，0～1MNaCl梯度洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并测定蛋白浓度。7.纯度鉴定及分子量测定样品进行15％SDS-PAGE，考马斯亮兰R-250染色后，Pharmacia Imagemaster VDS扫描测定纯度、分子量。纯度95％以上，分子量约15.5KD。8.生物学活性测定分别以酪蛋白凝胶板溶圈法、发色底物法测定。比活性9-10万HU/mg左右。9.Sak·纤溶酶复合物和RGD/KGD-Sak·纤溶酶复合物的Km和Kcat值测定分别将2μM纤溶酶原与22μM Sak或RGD/KGD-Sak在pH7.4，0.1MPB，37℃的条件下，混合反应30min，形成与纤溶酶的复合物。然后取催化量复合物，在pH7.4，0.1MPB，37℃条件下，按以下体系反应0-10min，每隔30s记录405nM OD值，每个不同的纤溶酶原浓度重复三次，取平均值。
反应体系终浓度Sak·纤溶酶(RGD/KGD-Sak·纤溶酶) 5nM发色底物S-2390 1mM纤溶酶原 1-30μMRGD/KGD-Sak.plasmin激活纤溶酶原的反应符合米氏方程(表2)。
表1 RGD/KGD-Sak.plasmin、Sak.plasmin激活纤溶酶原的酶促动力学常数比较Table 1 Kinetic analysis of activation of plasminogen by SakmoietiesKm(umol.l-Kcat(s-1) Kcat/Km1)Sak.plasmin 6.42 1.03 0.16RGD/KGD-12.501.41 0.11Sak.plasmin10.聚合能力检测实验野生型Sak为对照，以生理盐水溶解，取30mg/ml、3mg/ml高、低二种蛋白质浓度，室温静置。每24h取样，电泳鉴定。
在二种蛋白质浓度下，RGD/KGD-Sak比野生型Sak的聚合能力显著降低。11.豚鼠致敏试验分别以灭菌生理盐水溶解重组野生型Sak或突变体RGD/KGD-Sak，配成浓度0.25万单位/ml供致敏用。每次给药，均重新开瓶配制新鲜溶液。取健康豚鼠8只，分二组，4只/组，分别间日腹腔注射r-Sak或RGD/KGD-Sak致敏豚鼠三次(剂量0.125万单位/只)，14日后行第一次iv攻击，21日行第二次iv攻击(剂量0.25万单位/只)。并取健康未致敏豚鼠2只，静脉注射上述样品(剂量0.25万单位/只)，观察有无同类反应，以排除供试品药理、毒理作用的干扰。
野生型r-Sak组3只豚鼠呈IV级阳性反应，1只呈II级阳性反应。
RGD/KGD-Sak1只豚鼠呈I级阳性反应，其余无明显反应。
以上结果表明与野生型r-Sak相比，RGD/KGD-Sak的免疫原性显著下降。12.血小板聚集抑制试验将用0.1体积，110mM枸橼酸三钠抗凝的新鲜血液低速离心(150g，10min)，得富含血小板的血浆(HRP)。在连续搅拌条件下，RGD-Sak(终浓度2μM)与HRP 37℃孵育2min后，向HRP中加入ADP(终浓度20μM)作为诱导剂，以双通道血小板聚集仪测定5min内血小板的聚集率。分别以2μM野生型r-Sak、生理盐水为对照。
结果显示，RGD/KGD-Sak组的聚集率(5％±2％，n＝3)明显低于r-Sak组(58％±3％，n＝3)和生理盐水组(59％±3％，n＝3)。表明RGD/KGD-Sak有很强的抑制ADP诱导的血小板聚集的能力。13.动物溶栓实验应用本发明所制备的RGD/KGD-Sak进行动物溶栓实验，证实RGD/KGD-Sak保持了与野生型Sak一致的溶栓性能。(1) RGD/KGD-Sak治疗实验性兔股动脉血栓，用动脉造影显示，治疗前股动脉中段以下不显影，静脉注射RGD/KGD-Sak0.1mg/Kg，60分钟后再造影，股动脉充盈完全，循环恢治疗前股动脉中段以下不显影，静脉注射RGD/KGD-Sak0.1mg/Kg，60分钟后再造影，股动脉充盈完全，循环恢复，与野生型Sak组一致，而对照组未见股动脉充盈。治疗组6只，野生型Sak组3只，空白对照组3只。(2) RGD/KGD-Sak治疗实验性家兔前房积血眼内注射RGD/KGD-Sak10-20μg，4小时后可见前房血凝块溶解，红细胞沉降后与房水形成一界面，至24小时，眼内积血以被清除。与野生型Sak组一致，而对照组兔前房积血未见明显变化。治疗组6只，野生型Sak组4只，对照组4只。
附图
为RGD/KGD-Sak的氨基酸序列，斜体为突变位点。
权利要求
1.一种新型重组葡激酶，其特征在于改变野生型Sak二聚体结合面，即47-56位氨基酸(HR1)、104-113位氨基酸(HR2)区的疏水性氨基酸，然后构建重组表达质粒，制备新型葡激酶分子。
2.按权利要求1所述的新型重组葡激酶，其特征在于所述新型葡激酶分子的蛋白质结构为野生型Sak肽链的Lys109-Gly110-Phe111替换为Arg109-Gly110-Asp111(RGD)或Lys109-Gly110-Asp111(KGD)。
3.一种新型重组葡激酶的制备方法，其特征在于采用下列步骤(1)质粒pST-Sak为模板，以上游引物、突变引物、下游引物进行三轮PCR扩增，与质粒pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变；(2)突变体RGD/KGD-Sak基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，温度诱导RGD/KGD-Sak基因表达。表达产物以包涵体的形式存在于工程菌内；(3)发酵技术用低营养培养基扩增工程菌，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等进行补料，发酵参数为温度30-42℃，氧容量为50％-80％，pH＝6-8，搅拌速度随DO升高而降低；工程菌发酵后用高压破碎，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，尿素或盐酸胍溶解，稀释复性后用凝胶过滤，离子交换二步法纯化RGD/KGD-Sak产品。
全文摘要
本发明属生物技术领域,具体涉及一种低聚合能力兼具防栓功能的新型重组葡激酶(RGD/KGD－Sak)的蛋白质结构和制备方法。根据对重组葡激酶单体、二聚体三维结构及其生化特性的分析,设计了新型葡激酶分子结构。通过PCR定点突变构建突变体RGD/KGD－Sak基因,然后与原核表达载体pLY－4重组,转化大肠杆菌,筛选高表达工程菌。工程菌经发酵扩增,破碎细菌,离心收集包涵体,复性后经二步法纯化RGD/KGD－Sak。所得产品冻干后,形成聚合体的能力显著下降,并能显著抑制ADP诱导的血小板的聚集,具有溶栓、防栓双重功能。
文档编号C07K14/31GK1264736SQ0011162
公开日2000年8月30日 申请日期2000年1月28日 优先权日2000年1月28日
发明者宋后燕, 宋钢 申请人:上海医科大学