一种球根鸢尾病毒检测引物及方法
【专利摘要】本发明根据鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物；并同时公开了利用该三对特异性引物同时对球根鸢尾叶片中的鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒进行检测的方法。本发明建立了一种通过一次反应就能同时检测出3种球根鸢尾病毒即鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒的检测方法，具有检测效率高、所需成本低的特点，且即使样本中3种球根鸢尾病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高的检测灵敏度。
【专利说明】-种球根鸢尾病毒检测引物及方法 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及生物学领域的一种植物病毒检测方法，具体涉及一种球根鸢尾病毒检 测引物及方法。 【【背景技术】】
[0002] 鸾尾轻花叶病毒（Iris mild mosaic virus，IMMV)、水仙潜隐病毒（Narcissus latent virus，NLV)和菜豆黄花叶病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害球根鸾 尾的三种主要病毒。
[0003] 在田间这三种病毒常常复合侵染，造成球根鸢尾花色斑驳、叶片产生花叶退绿、切 花的数量和质量明显下降，从而严重影响球根鸢尾的品质。当种球连续种植几年后，病毒积 累到一定程度，会造成种球的退化，失去再利用的价值，这几种病毒的复合侵染已经成为球 根鸢尾大规模生产的主要限制因素。目前，球根鸢尾病毒尚无特别有效的化学防治方法，因 此，对球根鸢尾进行病毒鉴定，结合茎尖组培脱毒使种球复壮，显得尤为重要，但在种球复 壮过程中，经常需要对其进行病毒检测。
[0004] 目前，植物病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术（即ELISA方法）， 但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一定程 度的假阳性反应、检测灵敏性相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于PCR 技术的病毒检测技术正在迅速发展，但单重PCR检测技术，一个反应只能检测一种病毒，若 应用于田间多种病毒复合侵染的球根鸢尾病毒的检测，则存在着耗时、耗力、费用高的问 题。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种球根鸢尾病毒检测引物及方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种球根鸢尾病毒检测引物， 其具体包括如下三个引物对：
[0007] 鸢尾轻花叶病毒引物对：正向引物5' -GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物 5'-CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3' ；
[0008] 水仙潜隐病毒引物对：正向引物5' -AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反向引物 5,-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3，；
[0009] 菜豆黄花叶病毒引物对：正向引物5' -AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物 5,-GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3,。
[0010] 进一步地，所述鸢尾轻花叶病毒引物对对鸢尾轻花叶病毒PCR扩增出770bp的产 物；所述水仙潜隐病毒引物对对水仙潜隐病毒PCR扩增出266bp的产物；所述菜豆黄花叶 病毒引物对对菜豆黄花叶病毒PCR扩增出186bp的产物。
[0011] 进一步地，利用上述三个引物对对球根鸢尾病毒进行检测，其检测方法如下：根据 鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列 分别设计合成出如权利要求1中所述鸢尾轻花叶病毒引物对、水仙潜隐病毒引物对及菜豆 黄花叶病毒引物对；然后分别利用鸢尾轻花叶病毒引物对对球根鸢尾叶片中的鸢尾轻花叶 病毒、水仙潜隐病毒引物对对球根鸢尾叶片中的水仙潜隐病毒、菜豆黄花叶病毒引物对对 球根鸢尾叶片中的菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR反应，最后将反应产物进行1 %琼脂糖凝 胶电泳分析和克隆测序比对。
[0012] 进一步地，所述mRT-PCR反应的反应体系和反应程序如下：
[0013] 反应体系：反应体系的总体积为50yL，含有0. 3yL5U/yL的Taq酶、5yL的 lOXTaq 酶 buffer、4 μ L2. 5mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 模板、0· 12-0. 32 μ mol/L 的鸢尾轻花叶 病毒正向引物、〇· 12-0. 32 μ mol/L的鸢尾轻花叶病毒反向引物、0· 08-0. 24μ mol/L的水仙 潜隐病毒正向引物、〇· 08-0. 24 μ mol/L的水仙潜隐病毒反向引物、0· 04-0. 24 μ mol/L的菜 豆黄花叶病毒正向引物、0.04-0. 24 μ mol/L的菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌 双蒸水；其中，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，所述鸢尾轻花叶病毒 正向引物、鸢尾轻花叶病毒反向引物、水仙潜隐病毒正向引物、水仙潜隐病毒反向引物、菜 豆黄花叶病毒正向引物、菜豆黄花叶病毒反向引物的浓度均是以反应体系的总体积50 μ L 为基准；
[0014] 反应程序：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，48-58°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循 环35次；72°C延伸10min ;4°C终止反应。
[0015] 本发明的有益效果在于：
[0016] 针对鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因 的核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物，并利用该三对特异性引物同时对 球根鸢尾叶片中的鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR反应， 建立了一种通过一次反应就能同时检测出3种球根鸢尾病毒即鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐 病毒和菜豆黄花叶病毒的检测方法，具有检测效率高、所需成本低的特点，且即使样本中3 种球根鸢尾病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高的检测灵敏 度。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0017] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0018] 图1为本发明中实施例一的1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0019] 图2为本发明中实施例二的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0020] 图3为本发明中实施例三的1 %琼脂糖凝胶电泳图。 【【具体实施方式】】
[0021] 本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制 本发明的范围，这些实施例仅用于说明本发明的实施方法。
[0022] 实施例一
[0023] 本发明一种球根鸢尾病毒的检测方法，根据鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜 豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的保守核苷酸序列分别设计合成了鸢尾轻花叶病 毒引物对、水仙潜隐病毒引物对及菜豆黄花叶病毒引物对，然后分别利用鸢尾轻花叶病毒 引物对对球根鸢尾叶片中的鸢尾轻花叶病毒，水仙潜隐病毒引物对对球根鸢尾叶片中的水 仙潜隐病毒，菜豆黄花叶病毒引物对对球根鸢尾叶片中的菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR反 应，最后将反应广物进行1 %琼脂糖凝I父电泳实验和克隆测序比对。
[0024] 其中，各引物对具体为：⑴鸢尾轻花叶病毒引物对（如SEQ ID N0 :1、2所示）：正 向引物 5' -GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物 5' -CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3' ；（2)水 仙潜隐病毒引物对（如SEQ ID N0:3、4所示）：正向引物5'-AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反 向引物5'-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3' ；（3)菜豆黄花叶病毒引物对（如SEQIDN0:5、6所 示）：正向引物 5' -AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物 5' -GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3'。
[0025] 另外， 申请人:为方便描述，以下将鸢尾轻花叶病毒简称为IMMV，水仙潜隐病毒简称 为NLV，菜豆黄花叶病毒简称为BYMV。本发明检测方法的具体操作步骤如下：
[0026] 步骤100 :根据鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外 壳蛋白基因核苷酸序列，利用Primer5. 0软件设计三对特异性引物（即所述鸢尾轻花叶病 毒引物对、水仙潜隐病毒引物对及菜豆黄花叶病毒引物对），再用DNAman软件对所设计的 三对特异性引物进行校正，证实三对引物间不存在自身匹配和竞争性扩增，以确保上述三 种病毒能扩增出差异明显的特异性片段，并由上海生工生物工程有限公司合成上述三对特 异性引物。
[0027] 步骤200 :RNA提取：将同时被IMMV、NLV和BYMV三种病毒复合侵染的球根鸢尾叶 片〇. 2g、健康叶片0. 2g分别进行RNA提取，并以健康叶片为阴性对照。RNA提取采用Trizol 法：〇. 2g球根鸢尾带病毒叶片或健康叶片放入研钵中，加入液氮研磨成粉状，接着将粉状 叶片置于第一离心管中，再加入lmL Trizol并剧烈震荡20?30S，然后将第一离心管置于 室温下静置5min以使叶片充分裂解，接着将第一离心管于lOOOOrpm下离心5min，将上清移 至第二离心管中，往第二离心管中加入200uL氯仿，并振荡混匀，于室温下放置3min，接着 在4°C、lOOOOrpm下离心15min，然后吸取上层水相至第三离心管中，往第三离心管中加入 0. 5mL异丙醇混匀，并于室温下放置10min，接着将第三离心管于4°C、lOOOOrpm条件下离心 10min，并弃去上清液，则RNA沉于管底；之后加lmL75%乙醇（DEPC处理水配制）于第三离 心管中并温和振荡第三离心管，得到悬浮液，再于4°C、lOOOOrpm条件下离心5min，并弃去 上清液，然后将第三离心管置于冰上晾干l〇min，最后用30uL DEPC处理水溶解RNA样品。
[0028] 步骤300 :反转录cDNA :将经步骤200处理所得的RNA反转录成cDNA，具体内容为： 将反应管置于冰上，加入 luL Primer 01igo(dt)、luL dNTP 混合物（10mmol/L)、4uL DEPC 处理水、4uL RNA样品至反应管中，轻轻混匀再进行稍微离心，接着将反应管置于65°C水浴 中加热5min后，立即将反应管置于冰上5min，接着将反应管稍微离心后再将反应管置于冰 上，并加入4uL5 X反转录酶缓冲液、0. 5uL20U/uL的RNAase抑制剂、luL200U/uL反转录酶、 4. 5uL DEPC处理水至反应管中，然后将反应管置于42°C水浴中加热60min,再将反应管置 于70°C下热击10min，最后终止反应。
[0029] 步骤400 :PCR扩增：以经步骤300处理所得的cDNA为模板，并以步骤100中获得 的三对引物为引物对同时进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
[0030] 为了进行对比，本实施例同时进行了单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应，即 PCR扩增反应的反应体系包括单重PCR反应体系和多重PCR反应体系，其中，单重PCR扩增 反应和多重PCR扩增反应的反应程序一致而反应体系不同。PCR扩增反应的反应体系和反 应程序具体内容如下：
[0031] 单重PCR反应体系：反应体系的总体积为50yL，包括0. 3yL5U/yL的Taq酶、 54 1^的10父了&1酶1311打61'、4 4 1^.5臟〇1/1的（1阶138、14 1^模板、14 1^(^111〇1/11丽￥或 NLV或BYMV的正向引物、1μ L10ymol/L IMMV或NLV或BYMV的反向引物，其余成分为灭菌 双蒸水。
[0032] 多重PCR反应体系：反应体系的总体积为50yL，含有0. 3yL5U/yL的Taq酶、 5以1^的10父丁&9酶1311打61'、4 4 1^.5臟〇1/1的(1阶1^、14 14莫板、0.164 111〇1/1的1丽￥正向 引物、0. 16ymol/L 的 IMMV 反向引物、0. 12ymol/L 的 NLV 正向引物、0. 12ymol/L 的 NLV 反 向引物、0. 12ymol/L的BYMV正向引物、0. 12ymol/L的BYMV反向引物，其余成分为灭菌双 蒸水；其中，所述IMMV正向引物和IMMV反向引物、NLV正向引物和NLV反向引物、BYMV正 向引物和BYMV反向引物的浓度均是以反应体系的总体积50 μ L为基准。
[0033] PCR 反应程序：94°C预变性 5min、94°C变性 30s、54°C退火 30s、72°C延伸 lmin，循 环35次；72°C延伸lOmin ;4°C终止反应。
[0034] 步骤500 :取5 μ L PCR产物以1 %琼脂糖凝胶（荧光染料）为电泳支持介质，在 0. 5 X ΤΒΕ和120V电压下电泳30min，然后在0. 5 μ g/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫 外透射仪观察，具体实验结果见图1。
[0035] 本实施例1 %琼脂糖凝胶电泳实验结果如图1所示，IMMV引物对的单重PCR扩增 反应结果如图1中的标识1所示，NLV引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识2所 示，BYMV引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识3所示，由IMMV引物对、NLV引物 对、BYMV引物对的三对引物参与的多重PCR扩增反应结果如图1中的标识4所示，健康叶 片的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识5所示。由图1可知，IMMV引物对的单重PCR 扩增反应得到扩增片段长度为770bp的条带，NLV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片 段长度为266bp的条带，BYMV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为186bp的条 带，由IMMV引物对、NLV引物对、BYMV引物对三对引物参与的多重PCR扩增反应，可同时得 到扩增片段长度770bp、266bp和186bp的三条明亮清晰的条带，可见，本发明可以一次性同 时检测出球根鸢尾的IMMV、NLV、BYMV三种病毒，且特异性好、检测效率高。
[0036] 实施例二
[0037] 将实施例一步骤400中的多重PCR反应体系得到的PCR扩增产物经割胶回收，然 后分别与PMD18-T simple vector进行体外连接，再挑取阳性克隆，最后提取质粒测序，以 检查鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的扩增结果。
[0038] 且测序结果为：IMMV、NLV和BYMV的扩增产物分别是由770、266和186个核苷酸 组成的序列，其中所述IMMV扩增产物序列如SEQ ID N0 :7所示，所述NLV扩增产物序列如 SEQ ID N0:8所示，所述BYMV扩增产物序列如SEQ ID N0:9所示。用NCBI分析同源性结 果表明，所得的扩增产物序列SEQ ID N0 :7与参考序列即IMMV的外壳蛋白基因序列的同源 率达到99%，序列SEQ ID N0 :8与参考序列NLV的外壳蛋白基因序列的同源率达到98%， 序列SEQ ID N0 :9与参考序列BYMV的外壳蛋白基因序列的同源率达到100%。由此可见， 所得的扩增产物SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9序列分别为IMMV、NLV和BYMV 的外壳蛋白基因的部分序列，从而证明了本发明检测结果的可靠性。
[0039] 此外，为了考察本发明球根鸢尾病毒的检测方法的灵敏度， 申请人:对实施例一步 骤200中的RNA样品进行10' 10_2、10_3、10_4、10_5 -系列的梯度稀释，然后经过多重RT-PCR 扩增反应，再进行1%琼脂糖凝胶电泳实验，具体结果如图2所示。由图2可知，IMMV、NLV 和BYMV三种病毒在样品浓度稀释100倍后均仍能扩增出特异条带，由此可见本发明具有很 高的灵敏度。
[0040] 实施例三
[0041] 多重RT-PCR同时检测IMMV、NLV和BYMV的应用：
[0042] 步骤1 :取样地点为福建省农科院花卉研究中心种质资源圃。随机选取6个大田 中有复合侵染症状的球根鸢尾叶片样品，且6个球根鸢尾叶片样品均为0. 2g ;接着对各样 品进行RNA提取（操作同实施例一的步骤200)，并将RNA反转录成cDNA (操作同实施例一 的步骤300)。
[0043] 步骤2 :以处理所得的cDNA为模板，并以本发明所述的三对引物为引物对同时进 行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体内容如下：
[0044] PCR反应体系：反应体系的总体积为50 μ L，含有0. 3 μ L5U/ μ L的Taq酶、5 μ L的 10父了&9酶131^€61'、4 4 1^.5臟〇1/1的（1阶1^、14 14莫板、0.2(^111〇1/1的1丽￥正向引物、 0.2(^111〇1/1的1丽￥反向引物、0.16 4 111〇1/1的1￥正向引物、0.16 4 111〇1/1的1￥反向弓| 物、0· 16ymol/L的BYMV正向引物、0· 16ymol/L的BYMV反向引物，其余成分为灭菌双蒸 水；PCR反应程序为94°C预变性5min、94°C变性30s、58°C退火30s、72°C延伸lmin，循环35 次；72°C延伸lOmin ;4°C终止反应。
[0045] 步骤3 :取5yL PCR产物以1 %琼脂糖凝胶（荧光染料）为电泳支持介质，在 0· 5 X TBE和120V电压下电泳30min，然后在0· 5 μ g/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫 外透射仪观察，具体实验结果见图3。
[0046] 本实施例的1 %琼脂糖凝胶电泳实验如图3所示，利用多重RT-PCR体系对6个球 根鸢尾叶片样品进行检测时，每个所述样品均能扩增出三条明亮清晰特异性条带，说明所 采集的样品受IMMV、NLV及BYMV三种病毒复合侵染，且扩增得到的特异性条带片段长度分 另ij 770bp、226bp和186bp，与实施例一中单重PCR检测结果一致。可见本发明检测方法可以 一次性同时检测出甘薯的IMMV、NLV、BYMV三种病毒，特异性好、检测效率高特异性好、效率 商。
[0047] 本发明针对IMMV、NLV和BYMV三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，分别设计 合成了三对相应的特异性引物，并利用该三对特异性引物同时对球根鸢尾叶片中的IMMV、 NLV和BYMV进行mRT-PCR反应，建立了一种新的PCR反应体系和反应程序，使mRT-PCR反应 得到了大小差异明显，长度分别为770bp、226bp和186bp的三条IMMV、NLV和BYMV的扩增 片段序列；本发明实现了一次反应就能同时检测出3种球根鸢尾病毒即IMMV、NLV和BYMV 的目标，因而本发明检测效率高，本发明所用试剂为分子生物学常用试剂，所需成本低，且 即使样本中3种球根鸢尾病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高 的检测灵敏度。
[0001] SEQUENCE LISTING 福建省农科院科学院作物研究所 <P0> -种球根鸢尾病毒检测引物及方法 <13()> 10000 <!60> 9 -|7(r Ρ; κ rl rersioti ^ 1 <210> 1 <211> 20 <2]2> DNA <213> 人丄序列 <400> I gcUiggUuiag cticctilaccil 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 cgtgctagtg acatatcggt aa 22 <210> 3 <21l> IH <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 aattggtgca tttggtgc 18 <210> 4 <21l> 20 <212> DNA <213> 人工序列
[0002] <400> 4 tcaaaagcgt aggggatcat 20 <2!0> 5 <211> 20 <2I2> DNA <213> 人工序列 <400> 5 agacac￡icag caggagatgt 20 <2!(?> 6 <211> 2() <212> DNA <213> 人工序列 <400 Ο gcttaccctg tcagagtaga 20 <2I0> 7 <211> 77() <2I2> DMA <213> iris mild mosaic virus <40()> 7 gaaggtaaag caccatacat ctcggactac gcgctgcgtc gtctatacac agaagaacaa 60 atgcctcagg agaatctaga tcagtatcta cgcgcacttg tagatatcgc taaagagcgt 120 gacgacgatc cacaatttgt agaacaccag tcaggtggga cggatactgt ggatgcagcg 180 gaccctttca agcgaaatca aaatcctatg cgtagcagcg aatcacaaac gtctagtcaa 240 cctgcaacaa cccctccaca gacacagctt gacaaagatg ttaatgttgg tacaagcggc 300 acatttcgca taccacgact aaagagctta agttcaaaac tttcacttcc aaaggtccga 360 ggtagcacag ccgtaaaccr accacatctg uacaataUi accccaacca agagcaactr 420 tcgaacacta gggctacgga cgaacaattt tcagcttggt atgaaggggt taagggt^ac 480
[0003] tatgatgtca cagatgatga gatgcacatc ataatgaatg gactgatggt gtggtgtatc 540 gagaatggta cttcaccaaa tctcaacggt atgtgggtta tgatggatgg agatactcag 600 gttacttatc cgatcaaacc actacttgat tacgcacaac ccacactacg tcaaatcatg 660 catcatttca gcaacttggc agaagcgtac attgaanaac agaattacga gagaccatac 720 atgccaaggt atgggcggat tcgaaacctt accgatatgt cactagcacg 770 <2I0> 8 <21l> 266 <2I2> [)ΝΛ <213> Narcissus latent virus <40()> 8 aattggtgca tttggtgcgc taacaacggc acatcgtccg aagttgatac gtcgcaaaca 60 atggagattc gcgatggttt tgggaaggtt caggctatcc ccattgaggt ttttgtgaac 120 ccagctgttg agaatggegg tttacgaaag ataatgagge atttctctgg cataactcac 180 gagattttaa aggctggtaa gcgaatgaca gcctggggaa ataagagggg etttaergag 240 aaatcaatga tcccctacgc ttttga 266 <2I0> 9 <21l> 186 <2I2> DNA <213> Bean yellow inosaic virus <400> 9 agacacacag caggagatgt caatcgtgat atgcacacca tgcttggtgt tegtatttag 60 agtatccgtc tttaaattct ctataatttg gcgttacatt acttaatact atgtattagt 120 gaggtttcac ctccagcatt ttaaattcag tatgtgtatc atteteteta ctctgacagg 180 gtaage 18o
【权利要求】
1. 一种球根鸢尾病毒检测引物，其特征在于：具体包括如下三个引物对： 鸢尾轻花叶病毒引物对：正向引物5' -GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物 5'-CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3' ； 水仙潜隐病毒引物对：正向引物5' -AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反向引物 5,-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3，； 菜豆黄花叶病毒引物对：正向引物5' -AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物 5,-GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3,。
2. 根据权利要求1所述一球根鸢尾病毒检测引物，其特征在于：所述鸢尾轻花叶病毒 引物对对鸢尾轻花叶病毒PCR扩增出770bp的产物；所述水仙潜隐病毒引物对对水仙潜隐 病毒PCR扩增出266bp的产物；所述菜豆黄花叶病毒引物对对菜豆黄花叶病毒PCR扩增出 186bp的产物。
3. -种球根鸢尾病毒检测方法，其特征在于：根据鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和 菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出如权利要求1中 所述鸢尾轻花叶病毒引物对、水仙潜隐病毒引物对及菜豆黄花叶病毒引物对；然后分别利 用鸢尾轻花叶病毒引物对对球根鸢尾叶片中的鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒引物对对球 根鸢尾叶片中的水仙潜隐病毒、菜豆黄花叶病毒引物对对球根鸢尾叶片中的菜豆黄花叶病 毒进行mRT-PCR反应，最后将反应产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
4. 根据权利要求3所述一种球根鸢尾病毒检测方法，其特征在于：所述mRT-PCR反应 的反应体系和反应程序如下： 反应体系：反应体系的总体积为50 μ L，含有0. 3 μ L5U/ μ L的Taq酶、5 μ L的lOXTaq 酶 buffer、4y L2. 5mmol/L 的 dNTPs、l μ L 模板、0· 12-0. 32ymol/L 的鸢尾轻花叶病毒正 向引物、0. 12-0. 32 μ mol/L的鸢尾轻花叶病毒反向引物、0. 08-0. 24 μ mol/L的水仙潜隐病 毒正向引物、〇· 08-0. 24ymol/L的水仙潜隐病毒反向引物、0· 04-0. 24ymol/L的菜豆黄 花叶病毒正向引物、0.04-0. 24 μ mol/L的菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸 水；其中，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，所述鸢尾轻花叶病毒正向 引物、鸢尾轻花叶病毒反向引物、水仙潜隐病毒正向引物、水仙潜隐病毒反向引物、菜豆黄 花叶病毒正向引物、菜豆黄花叶病毒反向引物的浓度均是以反应体系的总体积50 μ L为基 准； 反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性30s，48-58°C退火30s，72°C延伸lmin，循环35 次；72°C延伸lOmin ;4°C终止反应。
【文档编号】C12N15/11GK104059999SQ201410325043
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】黄敏玲, 樊荣辉, 钟淮钦, 吴建设, 林兵, 叶秀仙, 罗远华 申请人:福建省农业科学院作物研究所