本发明涉及生物工程
技术领域：
，尤其是涉及一种通过基因重组制得可以提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌。
背景技术：
：柠檬酸作为目前生产量最大的有机酸，全球产量已经达到170万吨，并且其需求正以每年3.5～4.0％的速度增长，我国虽然是柠檬酸的主要生产国和出口国，年产量占世界总产量的53％，但由于柠檬酸国际市场竞争激烈，整个柠檬酸行业处于非常困难的状况。国际上有大量的研究在不断推进柠檬酸发酵的生产工艺，同时作为发酵的基础，柠檬酸生产菌种黑曲霉的改良也一直是研究人员所关注的焦点，获得更优质的生产菌株对巩固我国柠檬酸生产大国的地位和促进柠檬酸行业的发展有重要的现实意义。柠檬酸发酵对碳源的吸收实际上就是对葡萄糖的吸收。Torres测定了黑曲霉吸收葡萄糖存在2个Km值，分别为260μM和3.67mM，说明存在高亲和力和低亲和力两套转运系统，而且由低亲和力的转运系统提供柠檬酸发酵所需的代谢流，但该系统仅在葡萄糖浓度>50g·L-1时起作用。葡萄糖的转运是柠檬酸发酵的第一个步骤，葡萄糖转运系统对柠檬酸发酵有直接的影响，因此尝试对葡萄糖转运系统进行调整可能可以增强柠檬酸的生产。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法。本发明获得的黑曲霉具有耐高温、耐酸、发酵时间短的特性，同时柠檬酸转化率、纯度较高，产量比现有菌株有较大幅度的提高。本发明的技术方案如下：一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌，所述重组黑曲霉菌为将黑曲霉的低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因整合到黑曲霉基因组上得到重组黑曲霉菌；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的表达受Pgas启动子调控。所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述Pgas启动子为低pH诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。一种低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因表达框，所述表达框包含Pgas启动子、低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因和trp终止子，按照Pgas-LGT1-trp的顺序排布。所述Pgas启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述trp终止子的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。所述重组黑曲霉菌的制备方法包括如下步骤：(1)构建低亲和力葡萄糖转运蛋白LGT1基因表达框Pgas-LGT1-trp；(2)构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp；(3)将步骤(1)和步骤(2)制得的基因表达框转化黑曲霉，经抗性筛选和PCR鉴定获得所述重组黑曲霉菌。所述步骤(2)中所述抗性基因表达框中gpdA为启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。所述步骤(2)中所述抗性表达框中hph基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本发明有益的技术效果在于：本发明利用低pH诱导型启动子启动LGT1蛋白在黑曲霉中表达，通过增强产酸阶段葡萄糖的摄取，从而提高柠檬酸的产量。本发明方法利用AspergillusnigerH915-1作为宿主，柠檬酸产量提高了6.5％；在42℃下发酵，产量提高40.3％，时间缩短10h；利用更偏酸的初始培养基，产量提高6.9％。具体实施方式下面结合实施例，对本发明进行具体描述。实施例(1)黑曲霉RNA的提取：将黑曲霉孢子接种到柠檬酸发酵培养基中，在温度为35℃转速为250r/min的条件下培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司RNeasyPlantMiniKit提取黑曲霉总RNA，用TAKARA公司PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser将RNA反转录成cDNA。(2)黑曲霉基因组DNA的提取：将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组。(3)LGT1蛋白表达框的构建：①利用引物trp-F(序列如SEQIDNO.7所示)和trp-R(序列如SEQIDNO.8所示)以pAN7-1为模板扩增trp终止子(序列如SEQIDNO.6)，序列上下游含PstI和HindIII位点，连接到pMD19上测序，用这两个限制性内切酶酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19上，得到pUC19-trp；②利用引物Pgas-F(序列如SEQIDNO.9所示)和Pgas-R(序列如SEQIDNO.10所示)从黑曲霉基因组中扩增Pgas启动子(序列如SEQIDNO.3)，序列两头含EcoRI和KpnI酶切位点，酶切，将该序列连接到同样酶切的pUC19-trp，得到pUC-Pgas-trp；③利用引物gas-LGT1-F(序列如SEQIDNO.11所示)以及Trp-LGT1-R(序列如SEQIDNO.12所示)进行RT-PCR扩增得到LGT1CDS的基因序列(序列如SEQIDNO.1，其氨基酸序列为SEQIDNO.2)，序列两端分别含有pUC-Pgas-trp约20bp同源序列，利用VazymeOneStepCloneKit进行同源重组，形成gas-LGT1-trp表达框，得到pGTH表达载体。用到的引物如下：trp-F：ctgcagGATCCACTTAAACGTTACTGAAATCtrp-R：aagcttCTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGPgas-F：gaattcCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCTPgas-R：ggtaccGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGACGas-LGT1-F：gttcacctcctcacGGTACCATGGGTGTCTCTAATATGATGTCTrp-LGT1-R：TAACGTTTAAGTGGATCGGATCCTTACTCGCGGAGCTCAGTGG(4)黑曲霉原生质体的制备和转化：①按3×105/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/min培养过夜，再用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；②称0.5g/L的lysingenzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μLSTC，混匀，制得黑曲霉原生质体；③在100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μLPEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mLPEG，室温放置10min，依次加入4mLSTC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有180mg/L潮霉素的下层培养基上，平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代，每个菌落进行3次单孢子继代。(5)黑曲霉基因组DNA的提取：将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3％麦芽提取物，0.5％胰蛋白胨)中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻，再用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组，以基因组为模板，以Gas-LGT1-F和Trp-LGT1-R为引物，PCR鉴定外源基因在基因组上的整合。对比例(1)潮霉素抗性表达框的获取：通过引物gpd-F(序列如SEQIDNO.13所示)和Ttrp-R-2(序列如SEQIDNO.14所示)从质粒pAN7-1(序列号Z32698.1)中扩增得到，该表达框序列包含PgpdA(序列如SEQIDNO.4)、hph(序列如SEQIDNO.5)和trp终止子(序列如SEQIDNO.6)。gpd-F：CAATTCCCTTGTATCTCTACACACAGTtrp-R-2：CTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG(2)黑曲霉原生质体的制备和转化：①按3×105/ml的浓度接种黑曲霉孢子至PDA液体培养基，30℃、200r/mi好好韩n培养过夜，再用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球；②称0.5g/L的lysingenzyme，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌，称取0.5g菌球，加入到酶解液中，37℃、100r/min震荡培养3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃、1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μLSTC，混匀，制得黑曲霉原生质体；③在100μL黑曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μLPEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mLPEG，室温放置10min，依次加入4mLSTC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有180mg/L潮霉素的下层培养基上，平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代，每个菌落进行3次单孢子继代。测试例：(1)将实施例、对比例所得黑曲霉、现有技术常用黑曲霉Co82、黑曲霉TN-A09分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以106/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，35℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表1所示。表1柠檬酸含量(g/100mL)转化率(％)发酵周期(小时)实施例18.29855对比例13.49260黑曲霉Co82139260黑曲霉TN-A0912.59260注：柠檬酸含量检测采用Agilent1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱条件：HPX87H色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为5mM硫酸溶液，流量为0.6mL/min，进样量为10μL，柱温为30℃，210nm波长紫外光检测。结果表明，本发明实施例制得菌株的柠檬酸产量和转化率优于现有黑曲霉深层有氧发酵柠檬酸技术水平。(2)将实施例、对比例所得黑曲霉、现有技术常用黑曲霉zjs-8分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以106/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基，42℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表2所示。表2柠檬酸含量(g/100mL)转化率(％)发酵周期(小时)实施例17.99460对比例10.766.870黑曲霉zjs-81061.8360由表2数据可以看出，本发明实施例制得黑曲霉菌株具有很好的耐高温性，在温度提高的情况下柠檬酸产量和转化率仍高于现有的黑曲霉zjs-8。(3)将实施例、对比例所得黑曲霉及黑曲霉Co82分别接种于ME培养基(麦芽提取物30g/L，胰蛋白胨5g/L)上35℃生孢培养7天，刮取孢子，以106/mL的接种量接种于种子培养基(玉米淀粉培养基，总糖含量10％，总氮含量0.2％，pH3.5)，37℃、250r/min培养24h，以1/10接种量转接发酵培养基(pH2.0)，42℃、250r/min发酵72h。发酵液离心去除菌体，稀释10倍，用滤膜过滤后用HPLC检测柠檬酸含量。测试结果如表3所示。表3柠檬酸含量(g/100mL)转化率(％)发酵周期(小时)实施例18.999.560对比例149360黑曲霉Co82139365由表3可以看出，本发明实施例所得菌种在较为苛刻的酸性条件下，仍具有较好的柠檬酸产量和转化率，相对较短的发酵周期，本发明重组菌种具有更好的耐酸性。SEQUENCELISTING<110>江南大学<120>一种提高柠檬酸产量的重组黑曲霉菌及其制备方法<130>1<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1683<212>DNA<213>LGT1基因的核苷酸序列<400>1atgggtgtctctaatatgatgtcccggttcaagcctcaggcggaccactctgagtcctcc60actgaggctcctactcctgctcgctccaactccgccgtcgagaaggacaatgtcttgctc120gatgacagtcccgtcaagtacttgacctggcgctccttcatcctgggtatcgtcgtgtcc180atgggtggtttcatcttcggttactctactggtcaaatctctggtttcgagactatggat240gacttcctccaacgtttcggtcaggaacaggcggatggatcctatgctttcagcaacgtc300cgtagtggtctcattgtcggtctgctgtgtatcggtactatgatcggtgccctggttgct360gctcctatcgcagaccgcatgggccgcaagctctccatctgtctctggtctgtcatccac420atcgtcggtatcatcattcagattgccaccgactccaactgggtccaggtcgctatgggt480cgttgggttgccggtctgggtgttggtgccctctccagcattgtccccatgtaccagagt540gaatctgctccccgtcaggtccgtggtgccatggtcagtgccttccagctgttcgttgcc600ttcggtatcttcatctcctacatcatcaacttcggtaccgagagaatccagtcgactgct660tcctggcgtatcaccatgggcattggcttcgcctggcccttgattctggctgttggctct720ctcttcctgcccgagtctcctcgtttcgcctaccgtcagggtcgtatcgatgaggcccgt780gaggttatgtgcaagctgtacggtgtcagcccgaaccaccgcgtcatcgcccaggagatg840aaggacatgaaggacaagctcgacgaggagaaggccgccggtcaggctgcctggcacgag900ctgttcaccggccctcgcatgctctaccgtaccctgctcggtattgctctgcagtccctc960cagcagctgaccggtgccaactttatcttctactacggaaacagtatcttcacctccact1020ggtctgagcaacagctacgtcactcagatcattctgggtgctgtcaacttcggtatgacc1080ctgcccggtctgtacgtcgtcgagcacttcggtcgtcgtaacagtctgatggttggtgct1140gcctggatgttcatttgcttcatgatctgggcttccgttggtcacttcgctctggatctt1200gccgaccctcaggccactcctgccgctggtaaggccatgatcatcttcacttgcttcttc1260attgtcggtttcgccaccacctggggtcctatcgtctgggccatctgtggtgagatgtac1320cccgcccgctaccgtgctctctgcattggtattgccaccgctgccaactggacctggaac1380ttcctcatctccttcttcacccccttcatctctagctccattgacttcgcctacggctac1440gtctttgctggatgctgtttcgccgccatcttcgttgtcttcttcttcgtcaatgagacc1500cagggtcgcactcttgaggaggttgacaccatgtacgtgctccacgtcaagccctggcag1560agtgccagctgggttcccccggagggcattgtccaggacatgcaccgccccccttcctct1620tccaagcaggagggtcaggctgagatggctgagcacaccgagcccactgagctccgcgag1680taa1683<210>2<211>560<212>PRT<213>LGT1基因的氨基酸序列<400>2MetGlyValSerAsnMetMetSerArgPheLysProGlnAlaAspHis151015SerGluSerSerThrGluAlaProThrProAlaArgSerAsnSerAla202530ValGluLysAspAsnValLeuLeuAspAspSerProValLysTyrLeu354045ThrTrpArgSerPheIleLeuGlyIleValValSerMetGlyGlyPhe505560IlePheGlyTyrSerThrGlyGlnIleSerGlyPheGluThrMetAsp65707580AspPheLeuGlnArgPheGlyGlnGluGlnAlaAspGlySerTyrAla859095PheSerAsnValArgSerGlyLeuIleValGlyLeuLeuCysIleGly100105110ThrMetIleGlyAlaLeuValAlaAlaProIleAlaAspArgMetGly115120125ArgLysLeuSerIleCysLeuTrpSerValIleHisIleValGlyIle130135140IleIleGlnIleAlaThrAspSerAsnTrpValGlnValAlaMetGly145150155160ArgTrpValAlaGlyLeuGlyValGlyAlaLeuSerSerIleValPro165170175MetTyrGlnSerGluSerAlaProArgGlnValArgGlyAlaMetVal180185190SerAlaPheGlnLeuPheValAlaPheGlyIlePheIleSerTyrIle195200205IleAsnPheGlyThrGluArgIleGlnSerThrAlaSerTrpArgIle210215220ThrMetGlyIleGlyPheAlaTrpProLeuIleLeuAlaValGlySer225230235240LeuPheLeuProGluSerProArgPheAlaTyrArgGlnGlyArgIle245250255AspGluAlaArgGluValMetCysLysLeuTyrGlyValSerProAsn260265270HisArgValIleAlaGlnGluMetLysAspMetLysAspLysLeuAsp275280285GluGluLysAlaAlaGlyGlnAlaAlaTrpHisGluLeuPheThrGly290295300ProArgMetLeuTyrArgThrLeuLeuGlyIleAlaLeuGlnSerLeu305310315320GlnGlnLeuThrGlyAlaAsnPheIlePheTyrTyrGlyAsnSerIle325330335PheThrSerThrGlyLeuSerAsnSerTyrValThrGlnIleIleLeu340345350GlyAlaValAsnPheGlyMetThrLeuProGlyLeuTyrValValGlu355360365HisPheGlyArgArgAsnSerLeuMetValGlyAlaAlaTrpMetPhe370375380IleCysPheMetIleTrpAlaSerValGlyHisPheAlaLeuAspLeu385390395400AlaAspProGlnAlaThrProAlaAlaGlyLysAlaMetIleIlePhe405410415ThrCysPhePheIleValGlyPheAlaThrThrTrpGlyProIleVal420425430TrpAlaIleCysGlyGluMetTyrProAlaArgTyrArgAlaLeuCys435440445IleGlyIleAlaThrAlaAlaAsnTrpThrTrpAsnPheLeuIleSer450455460PhePheThrProPheIleSerSerSerIleAspPheAlaTyrGlyTyr465470475480ValPheAlaGlyCysCysPheAlaAlaIlePheValValPhePhePhe485490495ValAsnGluThrGlnGlyArgThrLeuGluGluValAspThrMetTyr500505510ValLeuHisValLysProTrpGlnSerAlaSerTrpValProProGlu515520525GlyIleValGlnAspMetHisArgProProSerSerSerLysGlnGlu530535540GlyGlnAlaGluMetAlaGluHisThrGluProThrGluLeuArgGlu545550555560<210>3<211>1493<212>DNA<213>Pgas启动子的核苷酸序列<400>3ctgctctctctctgctctctttctgcgctctctgtgtcggcactaaccccgaatggggcg60ggtatcggcagtccgacggatctccgggggccgcacgtccagcgccgatcgttactcaac120cgagcagaggagagagagcagtgagcagtggtgtcaccgaccataaaaatgcttgcttct180gcccatccagccatcagttgtccagtctgctccattgtgtgccagtctcgcccccaaggc240cgcgcatctgaaaccaaccggttgggtgaaatcagccggcgggtggcacccgagcggcca300ctggctgggatcatcgcccgcaacgcgtcaacagcaatcaaacgaaggatgcgaaattat360tcagcgggcggttcctttccaatttttccccgttcctgtcagcatgtctactctatcata420ctgtaacattattatattgtgattatttttattctgggtgatgtgtccactggaccgcac480gtggaatgaagattttccttccctcgggacgagaaaccatggcgcagttggtgttgtgtg540cgtgtgtgtgcgtgtcggttgtccgaaaatcgccctaaactccgaggcacgcaccatttg600ccattaattcccttgcgattgatttctgcctgtccctgcgaccctttgtgaccctttgtg660accctttgaccctggattcaggggcttggtggactcatagcgatggggatagggactttt720gacccttttgaccctttgaccctcccattttccctggcctaagtacgctgtagtcgtaat780tatagaaagaatcttgcgtggactggggcaaaaggggaacagaacttatccatgtccgag840cagcgatcggccagtcaccaagccggctggatccgagacccgctacgtgggaactcccaa900gagtcgttaagcaaagccaagag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