专利名称：大毛霉液态发酵含果胶的废渣制备果胶酶的制作方法
果胶酶是一种工业用酶制剂，它的主要性质是降解果胶物质。果胶酶这一性质主要应用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶用于桔子脱囊衣，麻料脱胶，木材防腐以及反刍动物的饲料添加剂也有报道。
产果胶酶的菌种主要有两类，即真菌和细菌。真菌主要有曲霉属，青霉属和镰孢属以及克鲁维氏酵母等。目前国外仍多自黑曲霉，根霉和盾壳霉中提取此酶。本发明以大毛霉PE315(菌种保藏中心登记号CGMCC 0630)为生产菌液态发酵生产果胶酶。该方法主要特点如下1.以麸皮为碳源；2.以无机氮作为氮源；3.以含果胶的废渣作为诱导物；4.接种大毛霉PE315(菌种保藏中心登记号CGMCC 0630)，在接触空气条件下，于温度30-32℃，三角瓶装料旋转摇床240转/分振荡培养60-72小时达到产酶高峰；5.发酵液经离心，上清液即果胶酶液；6.经还原糖法测定酶活力，果胶酶产率(酶单位数/毫升发酵液)达到3.2单位/毫升发酵液。该方法制备果胶酶所用原料价廉，发酵周期短，过程容易控制，具有工业化开发价值。
本发明所述的果胶酶制备方法内容如下1.大毛霉(Mucor mucedo)是毛霉属中一个种，分布广泛，多出现在兽畜的粪便上，能产琥珀酸，3-羟基丁酮，脂肪酶。MIYAZAWA等人报道应用大毛霉进行樟脑醌的生物转化。CERTIK等人报道大毛霉生产γ-亚麻酸。本发明所用大毛霉PE315(菌种保藏中心登记号CGMCC 0630)经产酶培养基训化获得。该菌种保存于PDA培养基，其培养基组成如下马铃薯提取液1.0升，葡萄糖20.0克，琼脂15.0克。
2.产酶培养基组成比例(W/V)如下麸皮5％，氮3％，含果胶废渣3％。
3.液态发酵操作方法如下按2所述的原料比配置培养基。培养基被分装于500ml的三角瓶中，每瓶50ml于0.1Mpa压力下蒸气灭菌30分钟，取出降至室温，接种1所述方法制备的菌种，在接触空气条件下，于温度30-32℃，旋转摇床240转/分振荡培养72小时，发酵液离心，所得的上清液即为果胶酶。
4.果胶酶测定采用还原糖法，测定方法如下吸取1.6ml 0.25％柑橘果胶溶液(用0.05M，pH4.2柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液配制)，加入稀释一定倍数的酶液0.4ml，在40℃恒温水浴中反应25分钟，用3，5-二硝基水杨酸比色法测定其酶活力。此方法即利用3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。酶活力单位定义在pH4.2，温度40℃条件下每分钟生成1μmol的半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
实施例1不同菌种液态发酵产酶实验黑曲霉、溜曲霉两个菌种都能固态发酵产果胶酶，并且产酶较高。因此用大毛霉PE315(菌种保藏中心登记号CGMCC 0630，以下省略菌种保藏中心登记号)、黑曲霉、溜曲霉三个菌株进行液态发酵。
液态发酵产酶实验500ml三角瓶每瓶加入麸皮2.5克，葵盘粉1.5克，硫酸铵1.5克，水50ml，0.1Mpa压力下蒸汽灭菌30分钟，取出降至室温后，分别接种大毛霉PE315、黑曲霉、溜曲霉，在接触空气条件下，于温度30-32℃，旋转摇床240转/分振荡培养72小时，发酵液离心，所得的上清液即为果胶酶，所测得的酶活性结果如下表(表1)表1菌种 酶活力(单位/毫升发酵液)大毛霉PE315 3.19黑曲霉2.86溜曲霉2.64实施例2不同氮源对产果胶酶的影响菌种大毛霉PE315保存于冰箱内4℃ PDA培养基，半年转接1次，使用前转接到新配制的斜面。
液态发酵产酶实验麸皮，无机氮，诱导物添加量为5％(W/V)，3％(W/V)，3％(W/V)。500ml三角瓶每瓶加入麸皮2.5克，葵盘粉1.5克，无机氮1.5克，水50ml。所用氮源有硫酸铵、氯化铵。0.1Mpa压力下蒸汽灭菌30分钟，取出降至室温后，接种大毛霉PE315，在接触空气条件下，于温度30-32℃，旋转摇床240转/分振荡培养72小时，发酵液离心，所得的上清液即为果胶酶，所测得的酶活性结果如下表(表2)表2氮源 酶活力(单位/毫升发酵液)硫酸铵 3.21氯化铵 3.14实施例3不同诱导物对产果胶酶的影响菌种大毛霉PE315保存于冰箱内4℃ PDA培养基，半年转接1次，使用前转接到新配制的斜面。
液态发酵产酶实验麸皮，无机氮，诱导物添加量为5％(W/V)，3％(W/V)，3％(W/V)。500ml三角瓶每瓶加入麸皮2.5克，硫酸铵1.5克，诱导物1.5克，水50ml。所用诱导物有葵盘粉，甜菜渣，桔皮，香蕉皮。0.1Mpa压力下蒸汽灭菌30分钟，取出降至室温后，接种大毛霉PE315，在接触空气条件下，于温度30-32℃，旋转摇床240转/分振荡培养72小时，发酵液离心，所得的上清液即为果胶酶，所测得的酶活性结果如下表(表3)表3诱导物酶活力(单位/毫升发酵液)葵盘粉3.19甜菜渣3.08桔皮 2.84香蕉皮2.69
权利要求
1.以麸皮作为碳源，以无机氮作为氮源，以含果胶的废渣作为诱导物，接种经训化的大毛霉PE315(菌种保藏中心登记号CGMCC 0630)，在一定的温度、通风条件下进行液态发酵，发酵液经离心，上清液即果胶酶液。
2.在权利要求第1项所述的方法中，大毛霉PE315(菌种保藏中心登记号CGMCC 0630)为产果胶酶的唯一菌种，该菌种自大毛霉Mucor mucedo(Linnaeus)Fresenius3.15经产酶培养基训化获得，其发酵产酶效率因原料不同、控制条件不同而变化。
3.在权利要求第1项所述的方法中，作为制备果胶酶的微生物发酵诱导物是指葵花盘粉末、甜菜渣和果渣，它们经研碎后过40目筛。所述的葵花盘粉末是向日葵去掉葵花子后加工成含水12％以下的粉末；甜菜渣是指甜菜糖生产过程中产生的废渣(又称甜菜废粕或颗粒粕)，加工成含水12％以下的颗粒状态；果渣是指水果(如桔子，香蕉等)加工过程产生的废渣(即桔皮，香蕉皮等)，加工成含水12％以下的颗粒状态。在发酵培养基中，诱导物占培养基总重量的3％(W/V)。
4.在权利要求第1项所述的方法中，辅加的无机氮源指硫酸铵，氯化铵。在发酵培养基中，氮的含量占培养基总重量的3％(W/V)。
5.在权利要求第1项所述的方法中，碳源为麸皮，在发酵培养基中，碳源的含量占培养基总重量的5％(W/V)。
6.在权利要求第1项所述的方法中，液态发酵的温度为30-32℃，摇床转速为240转/分。
7.在权利要求第1项所述的方法中，发酵液经离心后，上清液即为果胶酶液制品。另根据使用要求，该酶液可于40℃之下减压浓缩成高浓度果胶酶产品。
全文摘要
本发明为一种用大毛霉液态发酵制备果胶酶的方法,属于微生物发酵领域。发明以麸皮作为碳源,以无机氮作为氮源,以含果胶的废渣作为诱导物,接种大毛霉PE315((菌种保藏中心登记号CGMCC0630),在接触空气条件下,于温度30－32℃,三角瓶装料旋转摇床240转/分振荡培养60－72小时达到产酶高峰。发酵液经离心,上清液即果胶酶液。经还原糖法测定酶活力,果胶酶产率(酶单位数/毫升发酵液)达到3.2单位/毫升。(酶活力单位定义为:在pH4.2,温度40℃条件下每分钟生成1μmol的半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。)
文档编号C12N9/00GK1343771SQ01141778
公开日2002年4月10日 申请日期2001年9月19日 优先权日2001年9月19日
发明者顾红燕, 张洪勋, 齐鸿雁 申请人:中国科学院生态环境研究中心