栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。本发明由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。
【专利说明】栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]压疮、糖尿病足、烧伤及慢性伤口内存在很多失活组织。失活组织是机会性感染的优良培养基，会阻碍伤口的愈合。因此有效的清创是必要的。目前临床上最常用的清创方式仍是手术清创。除此之外，还有采用蛋白水解酶的酶清创。酶清创可以将坏死或失活的组织分解清除，同时又不损害邻近正常组织，从而达到清创目的。己有描述将枯草菌蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶及链激酶作为清创剂。但这些清创酶各有优缺点，并且早期清创效果尚未能完全令人满意。
[0003]己发现栖土曲霉能够广生水解能力很强的栖土曲霉中性蛋白酶。但把栖土曲霉蛋白酶作为伤口清创酶并未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高的栖土曲霉蛋白酶在制 备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
[0005]本发明的技术解决方案是:
[0006]一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
[0007]所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。
[0008]所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得:
[0009](I)培养基的制备
[0010]发酵培养基配比为:麸皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2PO40.4%，加水至100%，并于120°C下高温灭菌30分钟；
[0011](2)粗酶液的制备液
[0012]将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30°C下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液；
[0013](3)栖土曲霉蛋白酶的分离
[0014]粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0，加入20%浓度的单宁酸，边加边搅拌；单宁酸用量为粗酶液重量的1% ;待沉淀完全后离心，收集沉淀；沉淀用pH7.2,0.02M磷酸缓冲液溶解；使用聚乙二醇洗脱单宁酸，在搅拌下加入10%浓度的PEG，使PEG与单宁酸之比值达到3: lml/g ;离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂；[0015](4)栖土曲霉蛋白酶的纯化
[0016]上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris -HCL 缓冲液溶解，上 DEAE -Sephadex A -25柱，然后用平衡缓冲液洗涤；层析共分离出7个峰，酶活力存在于Ρ2峰内；收集Ρ2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。
[0017](5)蛋白酶活力的测定
[0018]采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40°C，适当的PH条件下，I分钟内水解酪蛋白产生I微克酪氨酸所需的酶量为I个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.1xio5u/g。
[0019]本发明由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。
[0020]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0021]栖土曲霉 蛋白酶的制备
[0022](I)培养基的制备
[0023]发酵培养基配比为:麸皮3%、米糠I %、玉米粉HKH2PO40.4%，加水至100%并于120°C下高温灭菌30分钟。
[0024](2)粗酶液的制备液
[0025]将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30°C下培养72小时。终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液。
[0026](3)栖土曲霉蛋白酶的分离
[0027]粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0。加入20%质量浓度的单宁酸，边加边搅拌。单宁酸用量为粗酶液重量的I %。待沉淀完全后离心，收集沉淀。沉淀用pH7.2,0.02M磷酸缓冲液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脱单宁酸。在搅拌下加入10%质量浓度的PEG，使PEG (ml)与单宁酸(g)之比值达到3:1。离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂。
[0028](4)栖土曲霉蛋白酶的纯化
[0029]上述丙酮粉粗酶用少量pH8.4,0.05Μ Tris - HCL缓冲液溶解，上DEAE - SephadexA-25柱，然后用平衡缓冲液洗涤。层析共分离出7个峰，酶活力存在于Ρ2峰内。收集Ρ2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。
[0030](5)蛋白酶活力的测定
[0031]采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40°C，适当的PH条件下，I分钟内水解酪蛋白产生I微克酪氨酸所需的酶量为I个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.lX105U/g。
[0032]实施例1:烧伤组织体外酶清创效果
[0033]将猪耳皮片烧伤并将其经受栖土曲霉蛋白酶蛋白水解作用，监测由栖土曲霉蛋白酶对组织的裂解时间。根据如下方法进行分析:通过将皮肤与软骨分离并去除多余脂肪制备猪耳皮肤。煮沸猪耳皮片(约直径lcm) 20分钟模拟烧伤皮肤。将0.1g栖土曲霉蛋白酶粉与水相5ml混合，调节PH为7.0,并使用装配有塑料管的注射器或吸量管将其应用于细胞底部。在37°C的环境下孵育，检测猪耳皮肤的裂解时间。结果显示栖土曲霉蛋白酶于63.2±10.2分钟内对烧伤的猪耳皮肤进行了清创。结果详见表1。
[0034]表1:栖土曲霉蛋白酶的烧伤组织体外清创活性
[0035]
【权利要求】
1.一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用，其特征是:所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。
3.根据权利要求1或2所述的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用，其特征是:所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得: (1)培养基的制备 发酵培养基配比为:麸皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2P04 0.4%，加水至100%，并于120°C下高温灭菌30分钟； (2)粗酶液的制备液 将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30°C下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000 r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液； (3)栖土曲霉蛋白酶的分离 粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0，加入20 %浓度的单宁酸，边加边搅拌；单宁酸用量为粗酶液重量的1% ;待沉淀完全后离心，收集沉淀；沉淀用pH 7.2,0.02M磷酸缓冲液溶解；使用聚乙二醇洗脱单宁酸，在搅拌下加入10%浓度的PEG，使PEG与单宁酸之比值达到3: lml/g ;离心，收集 上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂； (4)栖土曲霉蛋白酶的纯化 上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris-HCL缓冲液溶解，上DEAE-S^hadex Α-25柱，然后用平衡缓冲液洗涤；层析共分离出7个峰，酶活力存在于Ρ2峰内；收集Ρ2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。
【文档编号】A61K38/48GK103977398SQ201410243456
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】陈宏林, 朱昌来 申请人:南通大学