原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于兽药【技术领域】，具体涉及原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用。所述应用中，原花青素添加必要的辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂或膏剂。本发明通过实验证实，原花青素能够提高大鼠肾小球数目，减小肾小囊囊腔宽和肾小球直径，降低肾脏TGF-β1、TIMP-1和P16的表达量；提高pRB在大鼠肾脏组织的表达。也即是说，原花青素具有抗肾脏组织衰老的作用，能够被用于制备抗畜禽肾脏组织衰老的药物。
【专利说明】原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用药物领域，具体涉及原花青素的新用途。
【背景技术】
[0002] 肾脏组织衰老是由干细胞衰退、DNA退化、衰老基因活跃以及饮食精神因素等各种 综合因素而致的结果，以肾小球硬化、肾间质纤维化和肾小管萎缩为特征。肾脏衰老时实质 和间质细胞数逐渐减少，细胞的增殖能力减退，甚至完全停滞，使功能细胞难以更新，肾脏 萎缩，机能减退。同时，DNA损伤修复能力下降，最终引起肾功能不全甚至肾功能衰竭，进而 引起尿毒症等一系列全身性疾病。
[0003] 动物与人一样，随着年龄的增加，其肾脏机能减退，肾脏内环境稳定能力与应激能 力下降，结构、组分逐步退行性变，并最终趋向死亡。肾脏随年龄而衰老是一种不可逆转的 现象。然而人类基于其所掌握的科学知识和对自身生命的爱惜，勤于保养，则可以延缓肾脏 组织的衰老过程。
[0004] 随着人类社会的发展，动物的生命价值也逐渐受到重视。尤其是一些宠物狗宠物 猫等，它们经常被视作家庭成员的一部分，采用一定措施延缓其肾脏的衰老，换取更长久的 相互陪伴，已成为众多动物主人的迫切需求。此外，对于生产型畜禽，遭遇急性、亚急性肾衰 时如果不予救治，既会给广大饲养者带来极大的损失，亦不符合人道主义法则。因此，开发 适于动物使用的抗肾脏衰老药物，已经成为兽药领域亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了提供一种原花青素的新用途。
[0006] 基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰 老药物中的应用。
[0007] 所述应用中，原花青素添加必要的辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂或 膏剂。其给药方式可以为口服给药、注射给药或透皮给药。
[0008] 原花青素是Oligomeric Proantho Cyanidins (0PC)的中文学名，是一种有着特 殊分子结构的生物类黄酮，一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物。原花青素通常 为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂，具有非常强的体内活性，能够清除体内 自由基。实验证明，0PC的抗自由基氧化能力是维生素 E的50倍、维生素 C的20倍，并且 能够迅速被机体完全吸收，口服20分钟即可达到最高血液浓度，代谢半衰期达7小时之久。
[0009] 本发明通过大量实验证实，原花青素能够提高大鼠肾小球数目，减小肾小囊囊腔 宽和肾小球直径，降低肾脏TGF-β ρ --ΜΡ-1和P16的表达量；提高pRB在大鼠肾脏组织的 表达。也即是说，原花青素具有抗肾脏组织衰老的作用，能够被用于制备抗畜禽肾脏组织衰 老的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是正常组大鼠与模型组大鼠外周血血清SOD值比较图； 图2是正常组大鼠与模型组大鼠外周血血清MDA值比较图； 图3是各组肾脏组织HE染色结果对比图； 图4是各组TGF-β 1和--ΜΡ-1的表达对比图； 图5是各组P16和pRB蛋白的表达对比图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0012] 实施例1 原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用：将原花青素粉装入胶囊直接制成 胶囊剂。
[0013] 实施例2 原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用：按重量比称取原花青素10份、淀 粉30份、糊精25份、蔗糖25份，制成片剂。
[0014] 实施例3效果实验 (一）材料与方法 1. 1实验动物 选用8周龄SD雄性大鼠100只，体重180-220g，购自西安交通大学动物医学院实验动 物中心。
[0015] 1.2药品及试剂 原花青素，美国sigma公司生产；D-半乳糖购自上海试剂二厂；S0D试剂盒购自南京 建成生物工程公司；MDA试剂盒购自南京建成生物工程公司；TGF-β i和--ΜΡ-1多克隆抗 体购自美国Santa Cruz公司；pl6和pRB单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗羊， 兔抗鼠二抗购自美国Santa Cruz公司；SP二抗试剂盒购自北京中山生物技术公司；DAB 显色试剂盒购自北京中山生物技术公司；APES购自北京中山生物技术公司；细胞裂解试 剂盒购自北京泰格美生物技术公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒购自北京泰格美生物技 术公司；Prestained Protein Marker购自上海吉泰新绎生物科技有限公司；PVDF膜购自 Millipore公司；ECL显色系统购自北京泰格美生物技术公司。
[0016] 1.3实验仪器 CSR-1-30型超纯水机购自北京爱思泰克公司；Morris水迷宫购自中国医学科学院药 物研究所；S648型电热恒温水浴箱购自上海跃进医疗器械厂，恒温范围（37-KKTC);电热 恒温水浴锅购自上海医疗器械三厂；细胞培养箱，日本三洋；制冰机购自日本SANK)公司； HXGL00450A型医用干燥箱购自江苏省墟沟电器厂；电热压力蒸汽消毒锅购自山东安得医 疗科技有限公司；TDL-40B离心机购自上海安亭科学仪器制造厂；S0RVALL Biofuge fresco 低温离心机购自德国；低温冰箱，日本SANYO公司；ESJZ00-4电子天平购自沈阳龙腾电子有 限公司；液体快速混合器YKH- I型购自江西医疗器械厂；HI98127酸度计购自HANNA公司； 10 μ 1微量移液器购自Eppendorf公司；20 μ 1微量移液器购自Eppendorf公司；50 μ 1微 量移液器购自Eppendorf公司；200 μ 1微量移液器购自Eppendorf公司；1000 μ 1微量移 液器购自Eppendorf公司；ΒΗ-2型OLYMPUS显微镜及摄像装置购自日本；光学显微镜购自 Olympus ;SZX-B水浴振荡器购自哈尔滨市东方电控开关厂；Hand Depress封口机器购自温 州市鼎力机械包装有限公司；1670扫描仪购自EPSON ;匀浆器，玻璃板、胶条、梳子，DYY-7型 转移电泳仪，DYY-6B型稳压稳流转移电泳仪购自北京市六一仪器厂。
[0017] 1.4实验设计和方法 1.4. 1亚急性衰老大鼠模型的制备 随机选取大鼠20只作为正常组（腹腔注射等量的生理盐水），其余大鼠腹腔注射6%的 D-半乳糖溶液（用生理盐水稀释），按300mg/kg/d给药，连续注射60d，建立亚急性衰老大 鼠模型。在造模的过程中测定衰老大鼠的外周血血清S0D、MDA含量的变化，并进行Morris 水迷宫行为测试，以确定模型是否建立成功。
[0018] 1. 4. 2动物的分组及处理 选用造模成功的衰老大鼠，随机分为：模型组、原花青素保护组（低、中、高剂量）组，每 组20只。模型组、正常组灌胃等量的生理盐水，其它各组分别灌胃原花青素（低、中、高剂 量），连续60d。低剂量按10 mg/kg/day，中剂量按20 mg/kg/day，每天灌胃一次。高剂量 组按40 mg/kg/day，每天分两次灌胃。
[0019] 标本处理：（1)每组选用10只大鼠经4%多聚甲醛灌注固定，取双侧肾，常规石蜡 包埋、切片，片厚5μπι。HE染色观察肾脏形态结构的变化，显微镜下计数肾小球数目，测量 肾小囊囊腔宽和肾小球直径；SP免疫组织化学方法检测肾脏中TGF-β i 4Ρ--ΜΡ-1的表达。 (2)其余大鼠断头处死，取双侧肾，液氮中保存，采用Western Blotting方法检测大鼠肾脏 组织pRB和P16含量。
[0020] 1. 4. 3测定外周血血清SOD、MDA的含量 参照南京建成生物工程公司试剂盒说明书方法操作。
[0021] 1.4. 4 Morris水迷宫进行定位航行测试 定位航行试验通过对训练大鼠游泳寻找平台，观测其逃避潜伏期长短可检测动物的学 习能力，以确定模型是否建立成功。共历时5d，每天上午、下午各2次。将大鼠面向池壁分 别从各象限的4个入水点放入水中，记录其在60s内寻找到平台的时间。如果大鼠在60s 未找到平台，潜伏期记为60s，并由实验者用手牵引其至平台上，让大鼠停留20s，再放回笼 中。每次间隔时间为lh，记录第5d的逃避潜伏时间。
[0022] 1.4.5形态学染色切片的制备 1.4. 5. 1取材及固定 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（5ml/kg)麻醉，开胸，经左心室插管入主动脉，灌注 PBS(0. 01m〇l/L，pH 7. 4)，待冲干净血液后，灌注预冷的4%多聚甲醛，然后取双侧肾，切成 小块，放入4%多聚甲醛后固定过夜。
[0023] 1.4. 5. 2 脱水、包埋 将固定好的肾组织块经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
[0024] 1.4. 5. 3连续切片，片厚5 μ m，每隔30张取蜡带分别贴于涂有蛋白甘油（用于普 通HE染色）和APES (用于免疫组化）的载玻片上。
[0025] 1. 4. 6 HE 染色 1. 4. 6. 1染色方法 常规苏木精-伊红染色，脱水、透明、封片。
[0026] 1.4.6.2 镜下计数 100倍视野下计数肾小球数目。每只动物计数3张切片，每张切片10个视野。400倍 视野下每片选取10个肾小球（能看到血管极或尿极），用测微尺测量肾小囊囊腔宽和肾小 球直径。
[0027] 1. 4. 7免疫组织化学染色 1. 4. 7. 1染色方法 切片脱蜡至水后，PBS(0. 01mol/L，PH 7. 4)浸泡冲洗3次，每次5min -入3%过氧化氢 -甲醇液，室温下孵育30min以消除内源性过氧化物酶的活性一蒸馏水冲洗，PBS浸泡冲 洗3次，每次5min -滴加正常山羊血清，37°C恒温箱湿盒内孵育30min -滤纸吸去血清，滴 加稀释后（1:100)的兔抗了6?-01和1'頂?-1多克隆抗体，4°C冰箱湿盒内过夜（20h) - PBS 浸泡冲洗3次，每次5min -滴加生物素标记的二抗（羊抗兔IgG)，37°C恒温箱湿盒内孵育 30min - PBS浸泡冲洗3次，每次5min -滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37°C恒 温箱湿盒内孵育30min - PBS浸泡冲洗3次，每次5min - DAB显色（lml蒸馈水加 Buffer 缓冲液、DAB显色液及过氧化氢各一滴，充分混匀后使用），光镜下监视一PBS浸泡冲洗，终 止显色一苏木精复染一梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0028] 阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤相同。
[0029] 1.4. 7. 2 结果判定 细胞内出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反应。
[0030] 1. 4. 7. 3定量数据处理 TGF- β i和--ΜΡ-1阳性率用Mivnt图像分析仪进行分析，每张切片随机选取10个视野， 每个视野计数总细胞数和阳性细胞数，计算出阳性细胞的百分比。每组计数3只动物的肾 脏，每个标本计数3张切片。
[0031] 1. 4. 8 Western blotting 检测 1.4.8. 1肾组织蛋白质提取 将肾组织加入预冷的PBS (含lmol/L NaF)后勻楽，离心（3000r/min，5min)，弃上清，力口 PBS混匀再次离心，直到上清液清亮为止。
[0032] 在沉淀中加入细胞裂解液，置冰上反应5min,振荡器上震荡30s,如此反复共 40min后，4?条件下离心（12000r/min, 15min)，收集上清液，即为提取的蛋白质。
[0033] 1.4. 8. 2蛋白质浓度测定 按B以蛋白含量定量法测定蛋白质浓度。
[0034] 1. 4. 8. 3免疫印迹法 制备4%积层胶和分离胶（P16-12%，pRB-8%)，将每例蛋白取量40 μ g，5倍上样缓冲液混 合均匀，沸水浴5-10min，自然冷却后用微量加样器依次加入上样孔内，以积层胶稳压80V， 分离胶稳压120V进行电泳，直至溴酚蓝移动至胶底部终止电泳。然后用湿式电转移法将蛋 白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2h。分别加入鼠抗鼠 P16抗体（1:200, Santa Cruz，CA)和羊抗鼠 pRB抗体（1:1000，Cell Signaling)，摇床室温孵育lh或4°C过夜。 TBST洗膜3次，每次lOmin。分别加入过氧化物酶标记的兔抗羊和兔抗鼠 IgG(l:1000)，摇 床室温孵育lh，TBST洗膜3次，每次lOmin。将PVDF膜平铺于保鲜膜上，加入ECL试剂，室 温下反应3min，在暗盒内曝光2_5min，显影，定影。
[0035] 1.5统计分析 所有数据均以（X 土s)表示，应用SPSS19.0统计软件进行统计处理。采用方差分析， 两两之间采用q检验，标准α =〇. 05。
[0036] (二）实验结果 2. 1血清SOD、MDA含量的变化 如图1和2所示，通过对比正常组大鼠与模型组大鼠外周血血清的S0D值和MDA值可 知，模型组大鼠的外周血血清S0D含量明显降低、MDA含量明显升高，与正常组大鼠相比有 显著性差异（P〈〇.〇l)。
[0037] 2. 2 Morris水迷宫定位航行测试结果 前2d正常组和模型组成绩无显著性差异，随学习时间的延长各组潜伏期均逐渐缩短， 连续5d的定位航行实验发现，模型组的潜伏期与正常组比较明显延长（P〈0. 01)，表明模型 建立成功。
[0038] 2.3肾脏组织HE染色结果 正常组肾小球分布密集，呈圆形或椭圆形，外周规整，血管球内毛细血管襻密集，肾小 囊的囊腔狭小。肾小管的管腔大多为规整、狭小。模型组肾小球分布稀疏，肾小球直径明显 增大，肾小囊囊腔显著增宽，血管球不规则而松散，体积缩小，缩向血管极一侧，并可见散在 的空泡样肾小球。肾小管多数管腔扩大，上皮细胞低矮变薄或有体积明显增大。可见淋巴 细胞浸润。
[0039] 原花青素用药后，肾脏组织的形态有所改善。图3是各组肾脏组织HE染色结果的 对比图，从图3可知，与模型组比较：原花青素低剂量组肾小球数目有所增加，肾小囊囊腔 和肾小管管腔缩小，但无统计学意义（P>〇. 05)，中高剂量组改善明显，高剂量组明显好于其 余各组（P〈〇. 01)。
[0040] 2. 4 TGF- β i在肾脏组织的表达 免疫阳性产物表达在细胞质，呈棕黄色或棕褐色，分布在肾小球毛细血管管壁，肾小 球壁层细胞，肾小管间质及间质血管管壁。如图4所示，模型组除分布在上述部位外，肾 小管上皮细胞也见表达，阳性率明显高于正常组（P〈〇. 01)。原花青素各组随剂量的增高 阳性率呈下降趋势。其中高剂量组和模型组有显著差异（P〈〇. 01)，并且好于其余治疗组 (Ρ〈0· 05)。
[0041] 2. 5 --ΜΡ-1的表达变化 免疫阳性产物表达在细胞质，呈棕黄色或棕褐色，位于肾小球球内系膜细胞、肾小管间 质和肾小管上皮细胞，肾小球毛细血管管壁见少量表达。如图4所示，模型组ΤΙΜΡ-1的阳 性率明显高于正常组（Ρ〈〇. 01);原花青素低、中剂量组--ΜΡ-1的表达有所下降，但与模型 组比较无显著差异（Ρ>〇. 05);原花青素组与模型组比较有差异（Ρ〈0. 05);高剂量组和模 型组差异显著（P〈〇.〇l)。
[0042] 2. 6 Ρ16蛋白的表达变化 Western Blotting结果显示（图5):模型组大鼠肾脏组织Ρ16含量明显高于正常组 (P〈〇. 01);原花青素组大鼠肾脏组织P16含量均低于模型组，且呈剂量依赖性，尤以高剂量 组与模型组差别显著（Ρ〈〇·〇1)。
[0043] 2. 7 pRB蛋白的表达变化 Western Blotting结果显示（图5):正常组大鼠肾脏组织pRB含量明显高于模型组 (P〈〇. 01)，原花青素组大鼠肾脏组织pRB含量均高于模型组，其中高剂量组大鼠肾脏组织 PRB蛋白含量水平最高，与模型组差别显著（P〈0. 01)。
[0044] (三）结论 实验结果表明，原花青素能够使衰老畜禽肾脏肾小球数目增多，使肾小囊囊腔缩窄，肾 小球直径变小等，从而改善畜禽肾脏组织的形态结构；能降低畜禽肾脏组织TGF-β i的表 达，从而减少ECM在肾间质的过量沉积，减轻肾间质的纤维化和肾小球的硬化；能降低衰老 畜禽肾脏组织TIMP-1的表达，提高明胶酶MMP的活性，促进ECM的降解，减轻肾间质的纤维 化和肾小球的硬化；能降低畜禽肾脏组织P16蛋白含量，磷酸化形式的RB含量显著升高，解 除细胞周期停滞，使细胞顺利进入S，促进细胞增殖，从而延缓衰老。也即是说，原花青素能 起到延缓肾脏衰老的作用，可用于制备抗畜禽肾脏组织衰老药物。
【权利要求】
1. 原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用。
2. 如权利要求1所述原花青素在制备抗畜禽肾脏组织衰老药物中的应用，其特征在 于，原花青素添加必要的辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂或膏剂。
【文档编号】A61P39/06GK104083358SQ201410243447
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】孙江宏, 李坤鹏, 管倩 申请人:河南牧翔动物药业有限公司