原花青素在抗寨卡病毒等黄病毒感染中的应用的制作方法

本发明涉及药学的技术领域，具体说是原花青素在抗寨卡病毒等黄病毒感染中的应用。

背景技术：

寨卡病毒(zikavirus)是一种主要通过伊蚊传播的蚊媒病毒。该病毒最早于1947年偶然通过黄热病监测网络在乌干达寨卡丛林的恒河猴中发现，随后于1952年在乌干达和坦桑尼亚人群中发现。2015年5月7日，泛美卫生组织和世界卫生组织宣布，巴西卫生当局确认了巴西东北部寨卡病毒的流行，在这之前寨卡主要是在非洲、东南亚和太平洋岛屿流行，然而，从2015年5月开始，美洲多个国家开始报道有寨卡的传播，并预测其他有寨卡媒介蚊虫的国家都将陆续会有病例报道。在随后不到一年的时间里，截至3月10日，世卫组织报道有本地传播病例的国家和地区已增至52个。截至2016年3月11日，我国已有13例输入性病例。目前，对于寨卡病毒的治疗多使用阿司匹林和非类固醇类抗炎药物，但寨卡和登革热存在同时感染的可能，以上药物可能会增加登革热出血的风险。目前尚无可用疫苗和有效的治疗方法。

目前已知，寨卡病毒属黄病毒科、黄病毒属，呈球形，为单股正链rna病毒，直径40-70nm，有包膜，长度约为10.8kb，编码大约3400多个氨基酸。寨卡病毒的抵抗力不详，但黄病毒属的病毒一般不耐酸、不耐热。60℃30min可灭活，70％乙醇、1％次氯酸钠、脂溶剂、过氧乙酸等消毒剂及紫外线照射均可灭活。寨卡病毒病可导致自限性感染，主要症状包括低热、斑丘疹、关节疼痛、结膜炎，其他症状包括肌痛、头痛、眼眶痛及全身无力等，这些症状通常持续2-7d。寨卡病毒病有造成神经和自身免疫系统并发症的风险，孕妇感染寨卡病毒常导致新生儿小头畸形。ns3蛋白酶是其多聚蛋白的蛋白酶解加工以使病毒复制所必需的，从而使ns3pro成为抑制病毒增殖的一个有吸引力的治疗靶点，寨卡病毒的ns2b-ns3蛋白酶复合物在病毒的整个生活周期中起关键调节作用，只有该蛋白酶复合物被激活并完成一系列水解反应后，病毒才能启动复制过程。因此，寨卡病毒的非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶复合物也成为一个关键的抗病毒药物靶标，所以针对寨卡病毒的非结构蛋白酶进行抑制剂筛选对寨卡病毒相关的药物研发具有很大的意义。

原花青素，英文名是oligomericproanthocyanidins(opc)，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物。原花青素(葡萄籽提取物)是一种新型高效抗氧化剂，是目前为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有非常强的体内活性。

但迄今为止，原花青素在抗寨卡病毒等黄病毒感染中的应用未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供原花青素在抗寨卡病毒等黄病毒感染中的应用。

本发明针对寨卡病毒等黄病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶的抑制剂，抑制剂为原花青素。

本发明所涉及原花青素cas号为4852-22-6，购买于topscience公司。通过设立阴性对照，发现原花青素对寨卡病毒等黄病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶都有很好的抑制活性，因此该化合物有望作为抑制寨卡病毒等黄病毒的潜在药物。

本发明提供一种用于预防或治疗含有黄病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶感染的药物，其活性成分为原花青素，该药物包含上述含有原花青素以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的针对寨卡病毒等黄病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶的抑制剂，这种抑制剂为原花青素。原花青素对寨卡病毒等黄病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶活性具有显著的抑制效果。

附图说明

图1是原花青素对zikans2b-ns3^pro抑制作用示意图

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明：

本发明采用的寨卡病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶的表达、纯化等方法步骤及化合物筛选方法参考文献方法(xiac,yangk,chenw,etal.mechanismsofactivationandinhibitionofzikavirusns2b-ns3protease[j].cellresearch,2016,26(11):1260.)寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95％的荧光底物ac-lkrr-amc作为底物；荧光强度测定的仪器为fluoraskanascent荧光仪(thermo),激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；

蛋白缓冲液组分为10mmtris,20％体积百分数的甘油，ph＝9.0,1mmchaps；用缓冲液配置冠状病毒主蛋白酶(终浓度100nm),加入化合物dmso溶解度(终浓度为20μm),310.15k放置10min,迅速加入荧光底物ac-lkrr-amc,底物浓度为50μm。每10s记录一次荧光读数，共测定100个点。1200rpm震荡20s,检测荧光值。不加备选样品，其他实验条件均相同。

以时间为x轴，荧光值为y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据荧光强度以及反应时间，采用graphpadprism5软件分析前100s的酶促反应的速率。设定v0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性ra(residualactivity,ra)(vi/v0)以及抑制率ir(inhibitionrate,ir)(1-vi/v0)。

对于剩余活性<20％的化合物进行复筛，排除操作失误造成假阳性的可能。对于剩余活性低于15％的化合物，设计荧光淬灭实验。综合考虑化合物的剩余活性百分率和荧光淬灭率就可以判断化合物对寨卡病毒非结构蛋白ns2b-ns3蛋白酶的抑制效果。因为该体系主要是通过荧光强度筛选，所以，当有荧光的化合物或者是与mca类似的化合物都会对体系产生干扰。另外，很多dnp类似的结构会淬灭体系的荧光而造成假阳性，为了排除假阳性结果，我们采用先将蛋白酶与荧光底物反应一段时间，让体系荧光达到最大值q1、再在体系中加入与实验组等量的化合物，并检测体系的荧光值大小为q2。将两者的荧光值按照公式计算得出荧光淬灭率qr((qr＝q1-q2)/q2*％)。当荧光淬灭率高于20％为假阳性结果需排除，当荧光淬灭率低于20％为阳性结果。

本发明涉及药学的技术领域，具体说是原花青素在抗寨卡病毒等黄病毒感染中的应用，原花青素在抑制寨卡病毒非结构蛋白酶ns2b-ns3时候ir>90％以上,在制备抗寨卡病毒等黄病毒非结构蛋白酶ns2b-ns3的小分子抑制剂方面有很大应用潜力。