专利名称：抑制人类免疫缺陷综合征病毒感染和增殖的药剂的用途的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及抑制人类免疫缺陷综合征病毒(HIV-1)感染和增殖的药剂，HIV-1感染免疫活性细胞，如巨噬细胞或树突细胞，并导致免疫系统的破坏。更具体而言，本发明涉及抑制人类免疫缺陷综合征病毒感染和增殖的药剂的用途，该药剂抑制人类免疫缺陷综合征病毒感染来源于人单核细胞的M型巨噬细胞及其增殖。
2.相关技术描述有超过4000万人感染人类免疫缺陷综合征病毒(HIV-1)，其中估计约有500万患者发展为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。AIDS是一种世界范围的传染病。对HIV-1感染患者的高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)在二十世纪九十年代早期出现。由于其在临床领域的应用，获得了较好的治疗效果，如降低AIDS患者血浆中的病毒计数，导致CD4数量的回复。
然而，另一方面，应当认识到，针对巨噬细胞(MΦ)的病毒仍在网状内皮组织中存在1)，2)，并且在接受HAART的患者中在HAART约半年到几年后发现HAART抗性株。此外，由于HAART治疗成本昂贵，发达国家的患者得以优先治疗，而发展中国家的患者不能接受这种治疗，因为发达国家与发展中国家(具有80％以上的HIV患者)的经济实力存在差异，而且这种治疗不能帮助中断病毒的国际分布，因此，为了抑制抗性株的出现，需要多种联合治疗，而且还有患者由于腹部综合征和造血损伤不能接受这种治疗的报道，因而指出了HAART的医学和社会应用的限制。
HIV-1是一种感染免疫活性细胞(如巨噬细胞和树突细胞)，破坏免疫系统的病毒。根据最近的研究，逐渐清楚了HIV-1在巨噬细胞中的感染和增殖对于HIV-1传染力的保持和致病机理的发展起重要作用3)，因此，希望研制可抑制HIV-1在巨噬细胞中感染和增殖的新药。
尽管进行了关于HIV-1感染巨噬细胞的大量实验，还用巨噬细胞株进行了许多研究，结果是，采用这些细胞株的实验结果不总是反映体内组织巨噬细胞的功能。Akagawa等人成功地由单核细胞分别诱导了发生HIV-1增殖的巨噬细胞和抑制HIV-1增殖的巨噬细胞这两种类型，进一步证实了抑制增殖的巨噬细胞可能是人肺泡巨噬细胞的一种模型，因此，在这种类似于体内巨噬细胞的系统中有可能分析HIV-1的感染、增殖和抑制其增殖的机制4)-9)。
另外，众所周知大环内酯类可有效治疗弥漫性全细支气管炎(DPB)和耳鼻科疾病，其作用机制已知，除了抗菌作用外，还可诱发抗炎症作用10)。特别是，有一篇报道指出，通过检查大环内酯类在组织中的积累，在巨噬细胞中观察到几百到一千倍于外周淋巴细胞的积累，因此，认为大环内酯类对巨噬细胞的作用是重要的。
根据上述背景，我们认为，研制可以弥补HAART的缺点、抑制HIV-1在巨噬细胞中的感染和增殖、旨在从淋巴网状内皮系统中去除针对巨噬细胞的HIV-1的药物，特别是根据世界水平基于AIDS治疗策略的观点研制便宜的化疗剂，对于HIV-1患者的治疗是有用的。
我们研究了已知的大环内酯类衍生物是否具有抑制HIV-1感染和增殖的作用，惊奇地发现，它们对HIV-1在巨噬细胞中的感染和增殖具有抑制作用，并且证实对增殖的抑制作用表现为抑制巨噬细胞中酪氨酸激酶Hck蛋白的表达(这是病毒生长必需的)，并抑制P38MAPK的激活，于是形成了本发明。
本发明的一个目的在于提供抑制人类免疫缺陷综合征病毒感染和增殖的药剂的用途，它可用于用便宜的化疗剂治疗HIV-1感染患者，以及用作HAART的辅药。
本发明涉及大环内酯类衍生物抑制人类免疫缺陷综合征病毒在来源于人单核细胞的巨噬细胞中感染和增殖的用途。来源于人单核细胞的巨噬细胞是M型巨噬细胞。病毒增殖的抑制基于大环内酯类对酪氨酸激酶Hck蛋白的抑制作用和对巨噬细胞P38MAPK激活(这是病毒增殖必需的)的抑制。对HIV-1增殖具有这种抑制作用的已知大环内酯类衍生物均包含于本发明中。
本发明使用的大环内酯类衍生物的优选实例有氧杂环十四烷-2，10-二酮，4[(2，6-双脱氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-7，12，13-三羟基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧；11-(1’-羟丙基)-3-[2，6-双脱氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧杂三环[9.2.1.1.9.6]-十五烷-1-酮；6，15，16-三氧杂三环[10.2.1.11，4]十六烷，红霉素衍生物；4，13-二氧杂双环[8.2.1]十三-12-烯-5-酮，7-[(2，6-双脱氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羟基-1-甲丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；氧杂环-十四烷-2，10-二酮，4-[(2，6-双脱氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-12，13-二羟基-7-甲氧基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-磺酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羟基-1-丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙酰基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-吗啉基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-[六氢-1(1H)-氮杂基]-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-羟基-肟-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-氨基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3-O-克拉定糖基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；和脱(3-O-克拉定糖基)-脱[3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐。
为了理解本发明，解释了抑制针对巨噬细胞的HIV-1在来源于人单核细胞的巨噬细胞中增殖的机制。实验材料与方法(1-1)来源于人单核细胞的巨噬细胞和肺泡巨噬细胞的制备如以前所报道的11)，利用人CD14抗体微珠(Miltenyi Biotec，德国)、磁性细胞分离系统(MACS)(Miltenyi Biotech，德国)和lymphoprep(Nycome Inc.，挪威)从健康志愿者的棕黄层分离人外周血单核细胞(PMBC)，然后通过正选择从PMBC中分离单核细胞。
来源于单核细胞的巨噬细胞如下制备在M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)(104U/ml，Morinaga Milk Co.提供)、粒细胞和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(500U/ml，日本Scheling Plough Co.，Osaka提供，或购自R & S Genzyme-TECHNE Inc.)存在下，用含有10％FCS(Nissui Seiyaku Co.，东京)的RPMI1640培养基培养回收的单核细胞7-8天。
由人单核细胞通过M-CSF的不同诱导制备的巨噬细胞称为M型巨噬细胞(M型MΦ或M-MΦ)，由人单核细胞通过GM-CSF的不同诱导制备的巨噬细胞称为GM型巨噬细胞(GM型MΦ或GM-MΦ)。此外，肺泡巨噬细胞(肺泡MΦ或M-MΦ)如下制备。回收由健康志愿者肺泡灌洗获得的肺泡灌洗液中的细胞，悬浮并附着于塑料上，然后洗掉未附着的细胞，剩下的附着细胞称为肺泡MΦ。
(1-2)HIV-1对巨噬细胞的感染HIV-1感染巨噬细胞如下进行。针对巨噬细胞的病毒株HIV-1JR-FL和HIV-1BAL以低浓度(p24抗原滴度50ng/ml，TCID50＝3000/ml病毒，终浓度100pg/ml)与MΦ、GM-MΦ和A-MΦ(调节为2.5×105/孔，Flacon No3043Becton Dickinson Labware，Inc.U.S.)接触感染2小时，洗掉未与巨噬细胞吸附的病毒，添加新鲜培养基培养。含M-MΦ的培养基添加M-CSF(104U/ml)，含GM-MΦ的培养基添加GM-CSF(500U/ml)。
本实验中，接触感染使用的病毒量调节为携带病毒阶段患者的病毒水平，携带HIV-1阶段患者的肺组织的病毒水平为几个到十个pg/ml-几百个pg/ml，肺泡MΦ感染的病毒水平为104个细胞中几个拷贝12)。
(1-3)感染和增殖的HIV-1的测定使用两种抗-p24抗体(Nu24和10B5)13)通过夹心ELISA，根据感染后培养上清液中释放的病毒颗粒检测病毒的增殖。用下列JAM62和JAM65作为LTR(HIV长末端重复)-缺口基因引物。下列JAM63和JAM64作为巢式PCR的内部引物。
JAM625′-GCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTG-3′JAM655′-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGCCC-3′JAM635′-GTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCC-3′JAM645′-CCGCTTAATACTGACGCTCTCGCAC-3′(1-4)酪氨酸激酶Hck蛋白和转录因子C/EBPβ蛋白的表达的测定将巨噬细胞在SDS-PAGE样品缓冲液中溶解，进行10％SDS-聚丙烯酰胺电泳，将凝胶上的蛋白质转移到immobilon P膜(MilliporeInc.U.S.)上，并通过Western blotting检测这些蛋白质的抗体，之后检测巨噬细胞中酪氨酸激酶Hck蛋白和转录因子C/EBPβ蛋白的表达。酪氨酸激酶Hck蛋白(N-30)的抗体和C/EBPβ(C-19)的抗体购自Santacluse Inc.(U.S.)。Western blotting用Amersham ELC试剂(Amersham International plc，Buckinghamshire，UK)检测。条带强度表示为PSL(光刺激发光)值(A/mm2)。
(1-5)用反义酪氨酸激酶Hck蛋白和转录因子C/EBPβ蛋白对巨噬细胞的处理Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的反义寡核苷酸探针(AS)、对应于它们的有义寡核苷酸探针(S)以及与转录和翻译无关的非有义寡核苷酸探针(NS)如下使用。
硫代磷酸酯-修饰的AS-Hck5′-TTCATCGACCCCATCCTGGC-3′
硫代磷酸酯-修饰的S-Hck；5′-GCCAGGATGGGGTCGATGAA-3′硫代磷酸酯-修饰的NS-Hck；5′-CCATATTTCCCGCTCGCGTG-3′硫代磷酸酯-修饰的AS-C/EBPβ；5′-CAGGCGTTGCATGAACGCGG-3′硫代磷酸酯-修饰的S-C/EBPβ；5′-CCGCGTTCATGCAACGCCTG-3′硫代磷酸酯-修饰的NS-C/EBPβ；5′-CCAGAGAGGGCCCGTGTGGA-3′这些探针溶解于不含血清的RPMI1640培养基中，其中lipofectin(Life Technology Inc.，U.S.)以5μm浓度在室温下溶解30分钟，向巨噬细胞中加入含有10％FCS的RPMI1640培养基(终浓度2μm)，37℃温育24小时。之后用培养基洗涤细胞，加入含有10％FCS、不含寡核苷酸的RPMI1640培养基，再培养24小时，之后用HIV-1感染。
(1-6)P38MAPK和ERK1/2激活的测定用P38MAPK抗体、抗ERK1/2抗体、抗酪氨酸磷酸化P38MAPK抗体和抗酪氨酸磷酸化ERK1/2抗体(New England Biolabs，Inc.U.S.)检测P38MAPK和ERK1/2的激活，通过Western blotting检测这些分子的磷酸化反应。结果(2-1)针对巨噬细胞的HIV-1株在M-MΦ和GM-MΦ中的增殖反应(2-1-1)培养上清液中HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ上p24蛋白的量M-MΦ和GM-MΦ用HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染，温育14天。以恒定时间检测巨噬细胞培养上清液中p24蛋白的含量。对于任一种HIV-1株，检测M-MΦ培养上清液中的p24蛋白[见
图1(A)和(B)]。
(2-1-2)HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ中的细胞病变以时间依赖的方式观察HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ的形态学改变。只在产病毒的M-MΦ中从温育第二天起观察到细胞簇的形成和细胞融合，在培养的第4-7天可见多核巨细胞的形成[见图2(A)]。另一方面，在不产生病毒的GM-MΦ中，观察到形态学(nomorphological)改变[见图2(B)]。该结果表明，针对巨噬细胞的HIV-1感染时巨噬细胞中的细胞病变作用，如聚簇、细胞融合和MGC形成，能作为测定病毒增殖的指标。
(2-1-3)HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ中胞内p24蛋白分布的分析M-MΦ和GM-MΦ用HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染，在感染第8天用p24抗体免疫染色。在M-MΦ中，在MGC及其周围细胞中观察到p24蛋白的表达[见图3(A)]。在GM-MΦ中未见p24蛋白表达[见图3(B)]。这些结果判断，GM-MΦ中的病毒产生抑制机制可能是病毒颗粒胞内形成和芽殖阶段之前的抑制机制。
(2-1-4)HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ中病毒DNA的检测M-MΦ和GM-MΦ用HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染，在感染第2天用LTR-gag引物通过巢式PCR检测病毒DNA的形成。检测了M-MΦ和GM-MΦ中的病毒DNA形成，M-MΦ中可见病毒增殖，GM-MΦ中未见病毒DNA形成[见图4(A)和(B)]。该结果表明，甚至在不可见病毒增殖的GM-MΦ中也发生病毒向细胞中的渗入和RNA向DNA的转化，表明在病毒DNA形成之后GM-MΦ中存在病毒形成的抑制机制。
(2-1-5)M-MΦ和GM-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的表达和HIV-1感染引起的表达改变由于来源于人单核细胞的M-MΦ强烈诱导HIV-1的增殖，而GM-MΦ抑制病毒增殖，我们检测了HIV-1感染敏感性的差异是否取决于宿主蛋白质表达的差异。结果证明这两种巨噬细胞中酪氨酸激酶Hck蛋白和转录因子C/EBPβ的表达不同。
当未感染病毒时，酪氨酸激酶Hck蛋白在M-MΦ中高表达，在GM-MΦ中低表达(见图5)。尽管在HIV-1BAL株感染第2天，M-MΦ表达酪氨酸激酶Hck蛋白增多，但GM-MΦ表达酪氨酸激酶Hck蛋白反而降低(见图5)。另一方面，对于未感染病毒的C/EBPβ蛋白的表达，高分子型(37kDa)只在M-MΦ中表达，但在GM-MΦ中可见高分子型和低分子型(23kDa)蛋白质的表达(见图6)。尽管在HIV-1BAL株感染后的第2天，未见M-MΦ表达C/EBPβ蛋白的改变，但在GM-MΦ中低分子量C/EBPβ蛋白的表达显著提高，并且诱发高分子型与低分子型比例(L/S比)的改变(见图6)。
(2-1-6)人肺泡MΦ的HIV-1感染敏感性和酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的表达的检测用GM-CSF由人单核细胞诱导的GM-MΦ证明在形态学、表面标志的表达、活性氧生产力和过氧化氢酶的表达上类似于人肺泡巨噬细胞13)，14)。我们检测了来源于人单核细胞的GM-MΦ与人肺泡MΦ的HIV-1传染敏感性是否相似。
用HIV-1BAL株感染肺泡MΦ(A-MΦ)后，通过巢式PCR测定病毒DNA，并通过ELISA根据培养上清液中p24蛋白的含量测定病毒的增殖。在感染后的任何检测时间都可见病毒DNA[见图7(B)]，但到温育14天时既未检测到p24蛋白也未见病毒产生[见图7(A)]。
通过Western印迹检测肺泡MΦ酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的表达，结果是酪氨酸激酶Hck蛋白的表达降低，C/EBPβ蛋白同工型的表达改变，即低分子型C/EBPβ蛋白(23kDa)的表达显著增强，并且L/S比降低(见图8)。这些结果提示，来源于人单核细胞的人肺泡MΦ和GM-MΦ中病毒生产的抑制机制可能十分相同。
(2-1-7)针对酪氨酸激酶Hck蛋白的反义寡核苷酸处理的M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白表达的降低，和HIV-1增殖的抑制M-MΦ用针对酪氨酸激酶Hck蛋白的反义寡核苷酸(Hck-AS)处理24小时，M-MΦ再温育24小时，检测酪氨酸激酶Hck蛋白的表达。结果是，与对照组(L)相比，酪氨酸激酶Hck蛋白的表达显著降低(见图9)。然而，在用有义探针(Hck-S)或无关探针(Hck-NS)处理的M-MΦ中，可见酪氨酸激酶Hck蛋白表达的抑制(见图9)。
用不同寡核苷酸预处理的这些M-MΦ用HIV-1BAL株感染，感染2天后检测酪氨酸激酶Hck蛋白的表达，只在反义探针(Hck-AS)添加组中见到酪氨酸激酶Hck蛋白表达的降低，在有义探针(Hck-S)或无关探针(Hck-NS)处理的M-MΦ中未见酪氨酸激酶Hck蛋白表达的抑制(见图10)。在感染后第4、7、10天检测培养上清液中p24蛋白的含量。在反义探针(Hck-AS)处理的M-MΦ中，在任何时间均可见明显含量的p24蛋白，但在有义探针(Hck-S)和无关探针(Hck-NS)处理的M-MΦ中，可见p24蛋白以时间依赖的方式增多(见图10)，这类似于只用lipofectin处理的对照组(L)。该结果表明，M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白的表达是HIV-1增殖所必需的。
(2-1-8)C/EBPβ反义寡核苷酸处理的GM-MΦ中C/EBPβ的表达和HIV-1的生长反应在用C/EBPβ反义寡核苷酸(C/EBPβ-AS)处理24小时并再培养24小时的GM-MΦ中，在用HIV-1BAL株感染2天后的GM-MΦ中，高分子同工型(37kDa)的表达相对恒定，但低分子同工型(23kDa)的表达显著降低，L/S比升高(见图11)。HIV-1进一步感染C/EBPβ-AS预处理的GM-MΦ诱导病毒增殖，并且在培养上清液中可见p24蛋白(见图12)。在添加C/EBPβ-S和C/EBPβ-NS的组中未见HIV-1生长促进作用和C/EBPβ表达的改变(见图11和图12)。
根据以上实验结果，清楚地表明来源于人单核细胞的M-MΦ和GM-MΦ对针对巨噬细胞的HIV-1有不同的传染敏感性，在M-MΦ中强烈诱导病毒增殖，反之，在GM-MΦ中抑制病毒增殖。此外，M-MΦ与GM-MΦ增殖模型的差异等同于酪氨酸激酶Hck蛋白和转录因子C/EBPβ蛋白的高分子同工型与低分子同工型在这些细胞中表达的差异。用反义寡核苷酸特异调节酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白同工型的表达的结果是，M-MΦ的病毒产生被完全调节，反之，在GM-MΦ中能诱导病毒的产生。
根据这些结果，清楚地表明，酪氨酸激酶是HIV-1在M-MΦ中增殖所必需的，C/EBPβ的低分子型同工型在抑制HIV-1在GM-MΦ中增殖方面起重要作用。此外，根据对人肺泡MΦ的HIV-1感染敏感性和酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ表达的分析结果，并且由于在来源于人单核细胞的人肺泡MΦ和GM-MΦ中HIV-1生长抑制的机制相同，对GM-MΦ的分析可能与对体内肺泡MΦ的分析高度相关。这些实验的结果表明，来源于人单核细胞的M-MΦ中HIV-1增殖机制的分析可用作研制具有HIV-1生长抑制作用的药物的基本实验系统。
根据以上结果，对来源于人单核细胞的M-MΦ表达酪氨酸激酶Hck蛋白和对P38MAPK激活(这是病毒增殖必需的)具有抑制作用的大环内酯类衍生物的优选实例可包括下列物质，这些物质可以购得，或根据参考文献所述的方法获得。
氧杂环十四烷-2，10-二酮，4[(2，6-双脱氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-7，12，13-三羟基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧(Sigma Inc.，U.S.)；下文称为EM。
11-(1’-羟丙基)-3-[2，6-双脱氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧杂三环[9.2.1.1.9.6]-十五烷-1-酮(参见P.Kurath等人，Exoperimentia 27，362，1971)；下文称为EM201。
6，15，16-三氧杂三环[10.2.1.11，4]十六烷，红霉素衍生物，或6，9，12-脱水红霉素A(参见P.Kurath等人，Exoperimentia27，362，1971)；下文称为EM202。
4，13-二氧杂双环[8.2.1]十三-12-烯-5-酮，7-[(2，6-双脱氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羟基-1-甲丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧](参见JP-A-7-247299)；下文称为EM703。
氧杂环十四烷-2，10-二酮，4-[(2，6-双脱氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-12，13-二羟基-7-甲氧基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧](参见S.Morimoto等人，J Antibiotics，43，286，1990或英国Apin ChemicalsLtd.的产品和日本Wako Pure Chemicals，Inc.的产品)；下文称为CAM。
红霉素衍生物的例子包括脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM703。脱(3’-N-甲基)-3’-N-磺酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM727。脱(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羟基-1-丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM744。脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM745。脱(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM742。脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM740。双-脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM721。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM722。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM723。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM724。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM725。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM728。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM729。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM730。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM731。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM738。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM739。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM732。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM733。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM736。双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM749。双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM726。脱(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM734。脱(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM735。脱(3’-二甲氨基)-3’-吗啉基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM747。脱(3’-二甲氨基)-3’-[六氢-1(1H)-氮杂基]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM748。脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-羟基肟-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM743。脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM746。脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-氨基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM750。脱(3’-N-甲基)-脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM751。脱(3-O-克拉定糖基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM737。脱(3-O-克拉定糖基)-脱[3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；下文称为EM754。
发明者Satoshi Omura等人发现了上述不同红霉素衍生物，并且申请了国际专利申请，国际公开文本WO 02/14338A1，包括假红霉素，预期它是一种新型抗炎剂。在WO 02/14338A1说明书中详述了红霉素衍生物的合成方法和化学结构，下面概述了每种红霉素衍生物的合成方法。
EM701的合成红霉素(12.4g)的冰醋酸溶液在室温下搅拌2小时，缓慢添加碳酸氢钠水溶液中和。用氯仿抽提反应混合物，用芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，通过蒸馏除去溶剂，获得粗提物。用硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01 10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM201(7.7g)。之后，向EM201(7.6g)的甲醇溶液中加入碳酸钾(1.4g)，回流2小时。待蒸馏掉溶剂后，将残余物溶解于碳酸氢钠水溶液中，用氯仿抽提。混合液用芒硝脱水，过滤，除去芒硝，然后通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化获得的粗提物，获得EM701(5.9g，白色粉末)。
脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM703)的合成在室温下向EM701(6.9g)的甲醇(52.0ml)-水(13.0ml)溶液中依次加入乙酸钠(3.9g)和碘(2.5g)，在50℃下搅拌3小时。搅拌过程中加入1N氢氧化钠水溶液，持续保持pH8-9。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用氨水(7.5ml)-水(200ml)稀释，并用二氯甲烷抽提。用芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，蒸馏掉溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM703(4.8g，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM721)的合成向甲醇(15ml)中加入钠(4.5g)制备甲醇钠的甲醇溶液，在0℃下依次加入EM703(195.4mg)和碘(353.6mg)，搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，加入硫代硫酸钠(0.8g)、氨水(0.5ml)和水(80ml)，并用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM721(166.3mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM722)的合成向EM721(21.0mg)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(26.6μl)和乙基碘(12.2μl)，在室温下搅拌4小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM722(7.0mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM723)的合成向EM721(21.0mg)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(26.6μl)和乙基碘(12.2μl)，在室温下搅拌4小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM723(10.3mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM724)的合成在0℃下向EM721(117.8mg)和N，N-二异丙基乙胺(298.6μl)的二氯甲烷(5.7ml)溶液中加入烯丙基溴(148.3μl)，在室温下搅拌2小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM724(21.9mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM725)的合成在0℃下向EM721(117.8mg)和N，N-二异丙基乙胺(298.6μl)的二氯甲烷(5.7ml)溶液中加入烯丙基溴(148.3μl)，在室温下搅拌2小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM725(64.3mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM726)的合成在0℃下向EM721(34.8mg)的二氯甲烷(1.6ml)溶液中加入乙酸酐(8.4μl)，搅拌10分钟，再在室温下搅拌30分钟。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇＝100∶1→20∶1)纯化粗提物，获得EM726(33.4mg，白色粉末)。
脱(3’-N-甲基)-3’-N-磺酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM727)的合成在0℃下向EM703(87.6mg)的二氯甲烷(4.2ml)溶液中加入甲基磺酰氯(9.3μl)，搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇＝100∶1 20∶1)纯化粗提物，获得EM727(37.2mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM728)的合成向EM721(106.3mg)和N，N-二异丙基乙胺(269.3μl)的二氯甲烷(5.2ml)溶液中加入3-溴丙炔(137.8μl)，在室温下搅拌24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM728(41.3mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM729)的合成向EM721(106.3mg)和N，N-二异丙基乙胺(269.3μl)的二氯甲烷(5.2ml)溶液中加入3-溴丙炔(137.8μl)，在室温下搅拌24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM729(27.9mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM730)的合成向EM721(23.5mg)的乙腈(2.3ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(59.6μl)和1-碘丙炔(33.3μl)，在80℃下回流20小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM730(5.7mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM731)的合成向EM721(23.5mg)的乙腈(2.3ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(59.6μl)和1-碘丙炔(33.3μl)，在80℃下回流20小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM731(12.0mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM732)的合成在室温下向EM721(88.8mg)和N，N-二异丙基乙胺(450.1μl)的二氯甲烷(4.3ml)溶液中加入苄基氯(297.3μl)，搅拌96小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM732(49.9mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM733)的合成向EM721(26.8mg)的乙腈(1.3ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(135.9μl)和苄基氯(89.7μl)，在80℃下回流60小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM733(19.6mg，白色粉末)。
脱(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM734)的合成向EM721(16.8mg)的乙腈(4.9ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(42.5μl)和1，5-二溴戊烷(33.2μl)，在80℃下回流24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM734(13.3mg，白色粉末)。
脱(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮(EM735)的合成向EM721(15.9mg)的乙腈(4.6ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(40.2μl)和1，4-二溴丁烷(27.6μl)，在80℃下回流24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM735(11.9mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM736)的合成向EM721(90.6mg)的乙腈(4.4ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(459.2μl)和2-溴丙烷(247.5μl)，在80℃下搅拌72小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM736(25.3mg，白色粉末)。原料EM721回收47.1mg。
脱(3-O-克拉定糖基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM737)的合成向EM701(201.6mg)的二甲基甲酰胺(5.6ml)溶液中加入一水合对甲苯磺酸(80.3mg)，在50℃下搅拌8小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液调节为pH8.0，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM737(84.7mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮(EM738)的合成向EM721(80.6mg)的乙腈(3.9ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(408.5μl)和1-溴己烷(328.7μl)，在60℃下搅拌24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM738(33.7mg，白色粉末)。原料EM721回收24.6mg。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM739)的合成向EM721(22.9mg)的乙腈(1.1ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(116.0μl)和1-溴己烷(93.6μl)，在60℃下搅拌72小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM739(20.1mg，白色粉末)。
脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM740)的合成在室温下向EM703(70.0mg)的二甲基甲酰胺(3.3ml)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(347.7μl)和1-溴-2-氟-乙烷(148.6μl)，搅拌48小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM740(36.0mg，白色粉末)。原料EM703回收25.5mg。
脱(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM742)的合成在室温下向EM703(64.6mg)的二甲基甲酰胺(3.1ml)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(320.9μl)和溴乙腈(128.3μl)，搅拌4小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM742(53.1mg，白色粉末)。
脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-氧杂-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM705)的合成向EM701(508.0mg)的二氯甲烷(24.0ml)溶液中加入四乙酸铅(508.0mg)，在室温下搅拌40分钟。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用饱和盐水-饱和碳酸氢钠水溶液(1∶1，v/v)稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01)纯化粗提物，获得EM705(282.7mg，白色粉末)。
脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-羟基-肟-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮(EM743)的合成在0℃下向EM705(116.5mg)和盐酸羟胺(32.0mg)的乙醇(0.9ml)溶液中缓慢加入吡啶(0.9ml)，搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)纯化粗提物，获得EM743(114.5mg，白色粉末)。
脱(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羟基-1-丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM744)的合成在室温下向EM703(68.1mg)的二甲基甲酰胺(3.3ml)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(338.3μl)和3-溴-1-丙醇(175.6μl)，搅拌48小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM744(27.7mg，白色粉末)。原料EM703回收22.5mg。
脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM745)的合成在室温下向EM703(21.5mg)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(106.8μl)和2-溴乙酸乙酯(67.6μl)，搅拌48小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM745(6.0mg，白色粉末)。
脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM746)的合成在-78℃下向EM705(37.7mg)的甲醇(2.9ml)溶液中加入硼氢化钠(21.8mg)，搅拌30分钟。将反应混合液的温度提高到0℃，再搅拌30分钟。通过TLC证实反应完成后，加入丙酮(0.5ml)终止反应。反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM746(35.8mg，白色粉末)。
脱(3’-二甲氨基)-3’-吗啉基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM747)的合成向EM721(18.1mg)的乙腈(2.6ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(45.8μl)和双(2-溴乙基)醚(33.1μl)，在80℃下搅拌24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM747(12.0mg，白色粉末)。
脱(3’-二甲氨基)-3’-[六氢-1(1H)-氮杂基]-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮(EM748)的合成向EM721(19.5mg)的乙腈(2.8ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(49.5μl)和1，6-二溴己烷(43.6μl)，在80℃下搅拌24小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM748(11.7mg，白色粉末)。
双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM749)的合成向EM721(18.0mg)的乙腈(2.6ml)溶液中依次加入N，N-二异丙基乙胺(45.6μl)和1，10-二溴癸烷(58.9μl)，在80℃下回流36小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM749(14.9mg，白色粉末)。
脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-氨基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或(EM750)的合成在0℃下向EM743(15.5mg)的乙醇(2.3ml)溶液中加入氧化钼(IV)(10.0mg)和硼氢化钠(10.5mg)，搅拌4小时。通过TLC证实反应完成后，加入丙酮(0.5ml)终止反应，反应混合液用饱和盐水-饱和碳酸氢钠水溶液(1∶1，v/v)稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM750(13.4mg，白色粉末)。
脱(3’-N-甲基)-脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-氧-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM706)的合成向EM701(508.0mg)的二氯甲烷(24.0ml)溶液中加入四乙酸铅(508.0mg)，在室温下搅拌40分钟。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用饱和盐水-饱和碳酸氢钠水溶液(1∶1，v/v)稀释，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01)纯化粗提物，获得EM706(71.6mg，白色粉末)。
脱(3’-N-甲基)-脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM751)的合成在0℃下向EM706(38.8mg)的甲醇(3.0ml)溶液中加入硼氢化钠(22.9mg)，搅拌1小时。通过TLC证实反应完成后，加入丙酮(0.5ml)终止反应，反应混合液用饱和盐水-饱和碳酸氢钠水溶液(1∶1，v/v)稀释，并用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM751(31.4mg，白色粉末)。
脱(3-O-克拉定糖基)-脱[3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮(EM754)的合成向EM703(132.4mg)的二甲基甲酰胺(3.8ml)溶液中加入一水合对甲苯磺酸(53.9mg)，在50℃下搅拌6小时。通过TLC证实反应完成后，反应混合液用水稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液调节为pH8.0，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有机层脱水，滤除芒硝，除去溶剂，获得粗提物。通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)纯化粗提物，获得EM754(50.2mg，白色粉末)。
图2(A)显示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的M-MΦ的细胞病变，(B)显示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的GM-MΦ的细胞病变。
图3(A)显示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的M-MΦ中p24蛋白的胞内分布，(B)显示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的GM-MΦ中p24蛋白的胞内分布。
图4(A)显示对HIV-1JR-FL株感染的M-MΦ和GM-MΦ中病毒DNA的检测，(B)显示对HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ中病毒DNA的检测。
图5显示M-MΦ和GM-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白表达的改变和HIV-1BAL株感染引起的表达。
图6显示M-MΦ和GM-MΦ中C/EBPβ蛋白表达的改变和HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ的表达。
图7(A)通过检测HIV-1BAL株感染人肺泡MΦ(A-MΦ)后培养上清液中的p24蛋白显示HIV-1生长反应，(B)显示病毒DNA的检测。
图8显示肺泡MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白表达的改变，和HIV-1BAL株感染引起的表达。
图9显示在HIV-1BAL株感染之前和之后，酪氨酸激酶Hck蛋白反义寡核苷酸处理的M-MΦ中Hck蛋白的表达。
图10显示在酪氨酸激酶Hck蛋白反义寡核苷酸处理的M-MΦ中HIV-1增殖的抑制。
图11显示在HIV-1BAL株感染之前和之后，C/EBPβ蛋白反义寡核苷酸处理的GM-MΦ中C/EBPβ蛋白的表达。
图12显示C/EBPβ蛋白反义寡核苷酸处理的GM-MΦ中HIV-1的增殖。
图13显示与添加DMSO相比，添加大环内酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图14显示与添加DMSO相比，添加大环内酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对GM-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图15显示与添加DMSO相比，添加大环内酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对来自不同人(3名患者)的M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图16显示与添加DMSO相比，大环内酯(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)的浓度对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图17显示与添加DMSO相比，添加大环内酯衍生物(EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对HIV-1感染的M-MΦ的细胞病变的影响。
图18显示大环内酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对HIV-1感染的M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白表达的影响。
图19(A)显示与DMSO相比，大环内酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对HIV-1感染的M-MΦ中P38MAPK激活的影响，(B)显示与DMSO相比，大环内酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)对HIV-1感染的M-MΦ中ERK1/2激活的影响。
图20显示与对照组相比，p38MAPK(SB203580)抑制剂和ERK1/2(PD98059)抑制剂对HIV-1BAL株感染的M-MΦ中病毒增殖的影响。
图21显示与DMSO相比，不同浓度的大环内酯(如EM722、EM730、EM732或EM736)对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图22显示与DMSO相比，不同浓度的大环内酯(如EM734、EM735、EM747或EM748)对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图23显示与DMSO相比，不同浓度的大环内酯(如EM743)对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图24显示与DMSO相比，不同浓度的大环内酯(如EM746、EM750或EM751)对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
图25显示与DMSO相比，不同浓度的大环内酯(如EM754)对M-MΦ中HIV-1增殖的影响。
为了显示本发明的生长抑制作用，在大环内酯衍生物中，EM、EM201、EM202、EM703、CAM、EM722、EM730、EM732、EM736、EM734、EM735、EM747、EM748、EM743、EM746、EM750或EM751均以100mM的浓度溶解于DMSO中，之后用培养基稀释使用。对照组是只用用来溶解大环内酯衍生物的DMSO处理的M-MΦ。
M-MΦ和GM-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入30μMEM、EM201、EM202、EM703、CAM、EM722、EM730、EM732、EM736、EM734、EM735、EM747、EM748、EM743、EM746、EM750或EM751，温育14天，以时间依赖的方式测定培养上清液中p24蛋白的含量。
实施例1EM、EM201、EM202、EM703或CAM对M-MΦ和GM-MΦ中HIV-1增殖的影响与对照组(DMSO)相比，在添加EM201或EM703的M-MΦ中，几乎未检测到p24，在培养第14天病毒的产生受到强烈抑制(见图13)。在添加CAM的M-MΦ中，可见大约1/2的抑制，但在添加EM或EM202的组中，可见病毒生产的抑制，但不如EM201和EM703强烈(见图13)。对于GM-MΦ，在添加EM、EM201、EM202、EM703或CAM的组中，类似于对照组(DMSO)，在所有测定点几乎均未见病毒产生(见图14)。用采自3名成人志愿者的人单核细胞衍生的M-MΦ进行的实验，获得与图13所示相同的结果(见图15)。
EM201和EM703对M-MΦ中HIV-1BAL的抑制作用是浓度依赖的，在3μM或更高浓度时完全抑制病毒的产生(见图16)。尽管不仅在EM201和EM703中而且在EM、EM202和CAM中也观察到300μM时的病毒增殖，但由于是在对照组(DMSO)中观察的，因此可能是由于用来溶解试剂的DMSO的细胞毒性，以后的实验将在30μM下进行。
实施例2EM、EM201、EM202、EM703或CAM对HIV-1感染的M-MΦ的细胞病变的影响M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入30μM EM、EM201、EM202、EM703或CAM，温育，观察细胞形态学。在对照组(DMSO)和添加EM、EM202或CAM的组中，略微观察到MGC的形成，这与实施例1所示的p24蛋白含量的增多相一致，但在添加EM201和EM703的组中，未见细胞病变作用，如MCG的形成(见图17)。
实施例3EM、EM201、EM202、EM703或CAM对HIV-1感染的M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白的影响如上所述，M-MΦ强烈表达酪氨酸激酶Hck蛋白，用反义寡核苷酸调节酪氨酸激酶Hck蛋白的表达能抑制HIV-1在M-MΦ中的增殖。该结果表明，酪氨酸激酶Hck蛋白的表达是M-MΦ中HIV-1增殖所必需的。由于EM201和EM703抑制M-MΦ中HIV-1的增殖，提示在这些试剂处理的M-MΦ中，酪氨酸激酶Hck蛋白的表达受到抑制。
因此，M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入30μM EM、EM201、EM202、EM703或CAM，温育，在感染后第2天通过Westernblotting检测酪氨酸激酶Hck蛋白的表达。EM、EM202和CAM组显示对病毒增殖没有如此强烈的抑制作用，其中观察到酪氨酸激酶Hck蛋白的抑制，但不如对照组(只用DMSO处理)强烈(见图18)。EM201和EM703组对病毒增殖显示强烈抑制作用，其中酪氨酸激酶Hck蛋白的表达受到强烈抑制(见图18)。
实施例4EM、EM201、EM202、EM703或CAM对HIV-1感染的M-MΦ中p38MAPK和ERK1/2激活的影响p38MAPK和ERK1/2(p42/44MAPK)参与胞内信号传导机制的多种反应。利用Western blotting检测HIV-1BAL株感染的M-MΦ中p38MAPK和ERK1/2的酪氨酸磷酸化。结果是，病毒感染强烈诱导p38MAPK的酪氨酸磷酸化，但ERK1/2的酪氨酸磷酸化较弱。该结果表明，p38MAPK的激活对于M-MΦ中的病毒增殖至关重要。
因此，检测了EM、EM201、EM202、EM703和CAM对p38MAPK和ERK1/2激活的影响，它们对M-MΦ中的病毒增殖具有抑制作用。
向HIV-1BAL株感染的M-MΦ中加入30μM EM、EM201、EM202、EM703或CAM，在培养的第2天利用Western blotting检测p38MAPK的酪氨酸磷酸化。在添加EM、EM202和CAM(它们对病毒增殖的抑制作用不是太强)的组中，可见p38MAPK的酪氨酸磷酸化降低，但不如对照组(DMSO)强。在添加EM201和EM703(它们强烈抑制病毒增殖)的组中，p38MAPK的酪氨酸磷酸化显著降低[见图19(A)]。在任何组中，p38MAPK的总量(磷酸化和非磷酸化p38MAPK的总和)相等。这些结果提示，M-MΦ中EM、EM201、EM202、EM703和CAM对病毒增殖的抑制参与p38MAPK的抑制。
另一方面，在添加EM、EM202和CAM(它们对病毒增殖的抑制作用不是太强)的组中，与对照组(DMSO)相同，ERK1/2的酪氨酸磷酸化较弱，但在添加EM201和EM703(它们对病毒增殖显示强烈抑制作用)的组中，可见ERK1/2的酪氨酸磷酸化增强。在任何组中，ERK1/2的总量(磷酸化和非磷酸化ERK1/2的总和)相等[见图19(B)]。
实施例5p38MAPK抑制剂对HIV-1感染的M-MΦ中病毒增殖的影响，添加本发明使用的EM、EM201、EM202、EM703和CAM可以抑制根据实施例4的结果，提示p38MAPK激活对于M-MΦ中HIV-1的增殖至关重要，EM、EM201、EM202、EM703和CAM对HIV-1增殖的抑制作用由这些物质对p38MAPK激活的抑制作用引起。
因此，向HIV-1BAL株感染的M-MΦ中加入浓度为10μM的p38MAPK抑制剂SB203580——(4-[4-氟-苯基]-2-[4-甲基亚磺酰苯基]-5-[4-吡啶基]-1H-咪唑)，和ERK1/2抑制剂PD98059——(2-[2-氨基-3-甲氧苯基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮)，并且检测对病毒的影响。
当向HIV-1BAL株感染的M-MΦ中加入10μM SB203580并温育时，甚至在第14天仍几乎未检测到p24蛋白，而且病毒增殖受到抑制(见图20)。另一方面，当加入10μM ERK1/2抑制剂PD98059时，对照组中p24蛋白的含量没有不同，并且可见病毒增殖(见图20)。根据这些实验结果，针对巨噬细胞的HIV-1株在M-MΦ中的增殖必须需要p38MAPK的激活，而认为ERK1/2的作用较小。
实施例6本发明使用的EM722、EM730、EM732和EM736对M-MΦ中HIV-1增殖的影响M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入不同浓度的EM722、EM730、EM732或EM736，温育10天，以时间依赖的方式测定培养上清液中p24蛋白的含量。只用用来溶解大环内酯衍生物的DMSO处理的组作为对照组。
根据培养天数，观察到在只添加DMSO的对照组的培养上清液中p24蛋白含量升高，并且可见HIV-1的增殖。然而，与对照组相比，在添加EM722、EM730、EM732或EM736的组中，根据试剂浓度，p24蛋白的产生受到抑制，并可见对病毒生产的抑制。特别是，在30μM浓度时，EM722、EM730、EM732和EM736中的任一种试剂均几乎完全抑制病毒的产生(见图21)。用试剂EM703、EM727、EM744、EM745、EM742、EM740、EM721、EM723、EM724、EM725、EM728、EM729、EM731、EM738、EM739、EM733、EM749和EM726获得类似于图21的结果。此外，用采自3名成年健康志愿者的人单核细胞衍生的M-MΦ进行的实验获得与图21相同的结果。
实施例7本发明使用的EM734、EM735、EM747和EM748对M-MΦ中HIV-1增殖的影响M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入不同浓度的EM734、EM735、EM747和EM748，温育10天，以时间依赖的方式测定培养上清液中p24蛋白的含量。只用用来溶解大环内酯衍生物的DMSO处理的组作为对照组。
根据培养天数，观察到在只添加DMSO的对照组的培养上清液中p24蛋白含量升高，并且可见HIV-1的增殖。然而，与对照组相比，在添加EM734、EM735、EM747和EM748的组中，根据试剂浓度，p24蛋白的产生受到抑制，并可见对病毒生产的抑制。特别是，在30μM浓度时，EM734、EM735、EM747和EM748中的任一种试剂均几乎完全抑制病毒的产生(见图22)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人单核细胞衍生的M-MΦ进行的实验获得与图22相同的结果。
实施例8本发明使用的EM743对M-MΦ中HIV-1增殖的影响M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入不同浓度的EM743，温育10天，以时间依赖的方式测定培养上清液中p24蛋白的含量。只用用来溶解大环内酯衍生物的DMSO处理的组作为对照组。
根据培养天数，观察到在只添加DMSO的对照组的培养上清液中p24蛋白含量升高，并且可见HIV-1的增殖。然而，与对照组相比，在添加EM743的组中，根据试剂浓度，p24蛋白的产生受到抑制，并可见对病毒生产的抑制。特别是，在30μM浓度时，EM743几乎完全抑制病毒的产生(见图23)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人单核细胞衍生的M-MΦ进行的实验获得与图23相同的结果。
实施例9本发明使用的EM746、EM750和EM751对M-MΦ中HIV-1增殖的影响M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入不同浓度的EM746、EM750和EM751，温育10天，以时间依赖的方式测定培养上清液中p24蛋白的含量。只用用来溶解大环内酯衍生物的DMSO处理的组作为对照组。
根据培养天数，观察到在只添加DMSO的对照组的培养上清液中p24蛋白含量升高，并且可见HIV-1的增殖。然而，与对照组相比，在添加EM746、EM750和EM751的组中，根据试剂浓度，p24蛋白的产生受到抑制，并可见对病毒生产的抑制。特别是，在30μM浓度时，EM746、EM750和EM751中的任一种试剂均几乎完全抑制病毒的产生(见图24)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人单核细胞衍生的M-MΦ进行的实验获得与图24相同的结果。
实施例10本发明使用的EM754对M-MΦ中HIV-1增殖的影响M-MΦ与HIV-1BAL株接触感染2小时，加入不同浓度的EM754，温育10天，以时间依赖的方式测定培养上清液中p24蛋白的含量。只用用来溶解大环内酯衍生物的DMSO处理的组作为对照组。
根据培养天数，观察到在只添加DMSO的对照组的培养上清液中p24蛋白含量升高，并且可见HIV-1的增殖。然而，与对照组相比，在添加EM754的组中，根据试剂浓度，p24蛋白的产生受到抑制，并可见对病毒生产的抑制。特别是，在30μM浓度时，EM754几乎完全抑制病毒的产生(见图25)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人单核细胞衍生的M-MΦ进行的实验获得与图25相同的结果。
如上所述，认为本发明使用的大环内酯衍生物对针对巨噬细胞的HIV-1在来源于人单核细胞的M-MΦ中的增殖具有抑制作用。特别是，公认EM201和EM703具有强烈抑制针对巨噬细胞的HIV-1在M-MΦ中增殖的作用，它们甚至在3μM浓度时仍几乎完全抑制病毒的增殖。在病毒接触感染后向初级培养基中只添加EM201或EM703，甚至在温育的后第14天，EM201和EM703对病毒增殖的抑制作用仍显示95％或更高的充分抑制作用。
此外，EM、EM202和CAM根据药物浓度也显示抑制病毒的产生，30μM浓度的EM722、EM730、EM732、EM736、EM734、EM735、EM747、EM748、EM743、EM746、EM750、EM751和EM754可见相同的抑制作用，几乎完全抑制。根据这一事实，认为抑制作用与大环内酯类的药理学性质有关，它们在组织巨噬细胞中积累，具有长期的作用。
如上所述，酪氨酸激酶Hck蛋白的表达是M-MΦ中HIV-1增殖所必需的，并且由于本发明的不同大环内酯衍生物抑制M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白的表达，提示这种抑制作用可能是这些物质对HIV-1增殖的抑制作用的作用机制之一。此外，由于对病毒增殖显示抑制作用的本发明的不同大环内酯衍生物可抑制p38MAPK的酪氨酸磷酸化，提示HIV-1增殖的抑制是基于这些物质对p38MAPK激活的抑制。
工业适用范围如上所述，本发明涉及大环内酯类衍生物抑制人类免疫缺陷综合征病毒在来源于人单核细胞的巨噬细胞中感染和增殖的用途。本发明不仅可用作抑制人类免疫缺陷综合征病毒感染和增殖的药物，而且预期具有作为HAART辅药的临床用途。
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8)Akagawa，K.S.，Takasuka，N.，Nozaki，Y.，Komuro，I.，Miyuki，A.，Ueda，M.，Naito，M.和Takahashi，K.由人单核细胞产生CD1+RelB+树突细胞和TRAP阳性破骨细胞样多核巨细胞.BLOOD884029-4039，1996.
9)Matsuda，S.，Akagawa，K.，Honda，M.，Yokota，Y.，Takabe，Y.和Takemori，T.粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子诱导的来源于人单核细胞的巨噬细胞中HIV复制的抑制.AIDS Research and HumanRetroviruses，111031-1038，1995.
10)《炎症和免疫和大环内酯类进展》，Sup.Kihachiro Shimizu和Satoshi Omura编写，Shoji KudoIyaku Journal，Inc.Osaka，1996.
11)Hashimoto，S.，Komuro，I.，Yamada，M.，Akagawa，K.S.IL-10抑制培养早期依赖GM-CSF的人单核细胞的存活，并且抑制巨噬细胞的产生.J.Immunol.1673619-3625，2001.
12)Nakata，K.，Weiden，M.，Harkin，T.，Ho，D.和Rom，W.N.(1995).HIV-1感染患者的肺泡巨噬细胞中前病毒的低拷贝数和有限变异性肺与血液巨噬细胞群体之间HIV-1遗传差异的证据.Mol Med1，744-757.
13)Kiyoko Akagawa，Iwao Komuro和Keiko Mochida来源于单核细胞的巨噬细胞的多样性.Inflammation and Immunity，8，360-366，2000.
Akagawa，K.S.，Takasuka，N.，Nozaki，Y.，Komuro，I.，Miyuki，A.，Ueda，M.，Naito，M.和Takahashi，K.由人单核细胞产生CD1+RelB+树突细胞和TRAP阳性破骨细胞样多核巨细胞.BLOOD 884029-4039，1996.
14)Komuro，I.，Keicho，N.，Iwamoto，I.和Akagawa，K.S.由于过氧化氢酶活性的基础和可诱导水平较高，人肺泡巨噬细胞和GM-CSF诱导的单核细胞来源的巨噬细胞是H2O2抗性的.J.Biol.Chem.27624360-24364，2001.
权利要求
1.大环内酯类衍生物抑制人类免疫缺陷综合征病毒在来源于人单核细胞的巨噬细胞中感染和增殖的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中来源于人单核细胞的巨噬细胞是M型M巨噬细胞。
3.根据权利要求1的用途，其中对病毒增殖的抑制作用是对M型M巨噬细胞中酪氨酸激酶Hck蛋白表达的抑制和对p38MAPK激活的抑制。
4.根据权利要求1的用途，其中大环内酯衍生物是下列之一氧杂环十四烷-2，10-二酮4[(2，6-双脱氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-7，12，13-三羟基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧；11-(1’-羟丙基)-3-[2，6-双脱氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧杂三环[9.2.1.1.9.6]-十五烷-1-酮；6，15，16-三氧杂三环[10.2.1.11，4]十六烷，红霉素衍生物；4，13-二氧杂双环[8.2.1]十三-12-烯-5-酮7-[(2，6-双脱氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羟基-1-甲丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；氧杂环-十四烷-2，10-二酮4-[(2，6-双脱氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-12，13-二羟基-7-甲氧基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-磺酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羟基-1-丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脱水-假红霉素A6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二苄基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；双-脱(3’-N-甲基)-3’-N-乙酰基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-吗啉基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-二甲氨基)-3’-[六氢-1(1H)-氮杂基]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-羟基-肟-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(12-羟基)-脱[12-(1-羟丙基)]-12-氨基-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3’-N-甲基)-脱[12-(1-羟丙基)]-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；脱(3-O-克拉定糖基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐；和脱(3-O-克拉定糖基)-脱[3’-N-甲基)-8，9-脱水-假红霉素A 6，9-半缩酮或其盐。
全文摘要
本发明涉及抑制人类免疫缺陷综合征病毒(HIV－1)感染和增殖的药剂，HIV感染免疫活性细胞，如巨噬细胞或树突细胞，并导致免疫系统的破坏，并且涉及已知化合物——大环内酯衍生物抑制人类免疫缺陷综合征病毒在来源于人单核细胞的M型巨噬细胞中感染和增殖的用途。本发明可用于以低成本化疗剂治疗HIV－1感染患者，另外，在临床上也可用作HAART的辅药。
文档编号A61P31/18GK1443538SQ0215592
公开日2003年9月24日 申请日期2002年12月11日 优先权日2002年3月7日
发明者大村智, 赤川清子, 砂塚敏明 申请人:社团法人北里研究所