专利名称：用益生菌对粘膜表面的细菌或病毒感染进行治疗或免疫治疗及用于此的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过增强非特异性粘膜免疫适于治疗或预防与粘膜表面相关的疾病，特别是治疗粘膜处感染性病症的方法和组合物。
以上集中于由特定抗原引起的特异免疫。非特异性免疫应答“坐落”于一系列细胞和分子上，并通过它们起作用，这些细胞和分子是强有力的效应器结构，其作用不具有通过抗原受体赋予的特异性。
对一系列包括在多种食物或配制形式中的肠道微生物(益生菌)的健康促进价值，人们的认识已有一段时间了。有关这些益生菌的价值的论断大部分是非特异性的，不具有科学依据，而且很大程度上以临床印象为基础。益生菌被认为通过重建推测的有益正常菌群来促进健康。目前已报道了益生菌在治疗某些特定肠道疾病中的用途。但是常被夸大的断言除降低其可信度外，并未巩固治疗益处。
在许多区域中，发生粘膜疾病(如，变态反应，感染)的倾向性的改变方式越来越多地与微生物/肠粘膜“经历”联系起来，这些包括与环境“无菌”和肠道细菌菌群改变相联系的变态反应和哮喘发生率改变以及接触过无毒大肠杆菌的婴儿中肠道感染和变态反应的减少。
因此，需要预防或治疗粘膜疾病(如感染，变态反应等)的改进的制剂和方法。也需要能用于阻止病毒再活化或再感染、和能用于治疗与病毒感染或再感染相关的疾病和并发症的制剂和方法。
本发明的目的在于克服或改进现有技术中的至少一些缺陷，或提供有用的替代方案。
发明简述本发明部分基于如下观察，即某些微生物，特别是乳芽孢杆菌属(lactobacillus)细菌能通过诱导特定的细胞因子“样式”致敏粘膜表面，从而造成不利于微生物寄居和/或微生物致病的环境；并部分基于有关非抗原激活的细胞可在共有粘膜系统内迁移的新证明。
对实施本发明有用的微生物可以具有也可以不具有传统的益生菌作用，但它们能改变细胞因子样式或平衡，或诱导Th1-型细胞应答。为方便起见，所述的有用微生物或其成分在这里也可以称为益生菌，而不论它们实际上是否有益生菌的作用。这一术语(“益生菌”)旨在将其他能诱导Th1-型细胞应答的佐剂包括在其范围内。
由此，第一方面，提供用于预防或治疗非肠粘膜表面的粘膜表面的慢性或急性感染或非期望的微生物寄居的方法，该方法包括向需要此治疗的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
在本发明的这一实施方案中，所述的粘膜表面优选地选自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，生殖道的和腺体的粘膜表面。所述的感染或寄居可以是急性的或慢性的，并可以是细菌性，真菌性或病毒性的。可以理解的是，慢性病毒感染包括某些可以起源于病毒感染的并发症，例如慢性疲劳综合征等。
第二方面，提供预防或治疗慢性或急性呼吸道粘膜表面疾病的方法，该方法包括对需要此治疗的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
优选地，所述呼吸道粘膜表面是上呼吸道粘膜表面，更优选地是口腔或肺的粘膜。
优选地，将所述益生菌或含益生菌的组合物施用于胃或肠的粘膜表面。
第三方面提供预防或治疗由扰乱细胞因子平衡或缺乏T细胞免疫应答所引起的慢性或急性粘膜表面疾病的方法，该方法包括对需要此治疗的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
优选地，所述粘膜表面选自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，肠的，生殖道的和腺体的粘膜表面。
评价细胞因子平衡的有用标记是一种或多种干扰素-γ(IFN-γ)，白介素-4(IL-4)和白介素-12(IL-12)。但其他已知的作为Th1或Th2细胞应答标记的细胞因子对于这一目的也是有用的。
优选地，所述益生菌是细菌，例如其可选自但不限于，乳酸细菌，分枝杆菌(Mycobacterium)种或双歧杆菌(Bifidobacterium)种。更优选的是使用能诱导Th1细胞应答的嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillusacidophilus)L.acidophilus)，发酵乳芽孢杆菌(Lactobacillus fermentum)L.fermentum)或牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)(M.vaccae)，或其部分。特别优选的是嗜酸乳芽孢杆菌。嗜酸乳芽孢杆菌，发酵乳芽孢杆菌或牝牛分枝杆菌可以以活的或灭活制剂的形式使用，条件是它们能诱导Th1应答。优选嗜酸乳芽孢杆菌和发酵乳芽孢杆菌以活制剂的形式使用。应当理解其他细菌也可能适合于作为此处定义的益生菌(无论其是否具有益生菌效果)，例如熟知的佐剂细菌，如干酪乳芽孢杆菌(L.casei)，植物乳芽孢杆菌(L.plantarum)，鼠李糖乳芽孢杆菌(L.rhamnosus)，短双歧杆菌(Bifidobecterium breve)等。
所需的剂量依粘膜表面疾病的性质而异，而不论是预防性还是治疗性使用、以及所涉及的生物体或瘤的类型。治疗参数和所需剂量是本领域的技术人员易于评定的。当所述益生菌是完整的活益生细菌时，优选的益生菌剂量是约1×108到约1×1012个生物体。
所述的益生菌可与一种或多种抗生素或一种或多种其他药物活性试剂结合施用。所述的益生菌可在抗生素治疗或其他活性剂治疗之前，同时或之后给药。
优选地，所述粘膜表面疾病是细菌感染，例如由假单胞菌(Pseudomonas)种，链球菌(Streptococcus)种，葡萄球菌(Staphylococcus)种，假丝酵母(Candida)种，螺杆菌(Helicobacter)种或嗜血杆菌(Haemophilus)种引起的感染。更优选的是非典型的流感嗜血杆菌(Haemophilus IFNluenzae)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，白假丝酵母(Candidaalbicans)和/或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。所述的粘膜疾病也可以是不适当的细菌或其他微生物寄居。例如所述的粘膜疾病可以涉及病毒例如埃-巴二氏病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒等的慢性或急性寄居或感染。本领域的技术人员明白本发明的方法和组合物也可用于治疗其他病毒的感染和/或寄居。
优选地，需要接受治疗的对象选自具有高感染危险的个体。但应当理解的是本发明的治疗方法适用于在任何对象中预防粘膜疾病。例如，可以适当地给暴露于各种应激物的对象应用本发明的治疗方法，其中所述应激物为能影响对象的免疫状况从而使其倾向于受到感染的应激物。例如疲劳和/或生理应激物，如运动员常会遇到的那些，易使这些对象发生呼吸道感染。这似乎是由粘膜表面免疫状况，特别是IgA分泌受损造成的。
在运动或训练之前、期间或之后，施用如本文所述的益生菌制剂能恢复他们的免疫系统状况，特别是呼吸道粘膜表面的免疫状况，从而对抗或预防感染。
优选地，所述益生菌或含益生菌的组合物是片剂或胶囊形式。但本领域的技术人员明白所述的益生菌组合物也可以是液体或其它固体制剂形式，还可以存在于食物源中，例如酸奶或其他乳产品，或类似的以诸如大豆为基础的非乳产品。
所述的治疗可以包括在远离具有疾病的粘膜表面的位置施用益生菌或含益生菌的组合物。例如所述的益生菌或含益生菌的组合物可施用于肠粘膜表面以治疗鼻咽的，胃的或上呼吸道的粘膜感染。
第四方面，提供改变对象的粘膜表面细胞因子平衡的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
第五方面，提供在对象的粘膜表面诱导Th1细胞免疫应答的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
第六方面，提供增强对象粘膜表面的干扰素-γ分泌的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
第七方面，提供减少对象粘膜表面的白介素-4分泌的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
第八方面，提供使对象粘膜表面恢复正常的细胞因子平衡的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
第九方面，提供致敏粘膜表面以实施免疫治疗的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
优选地，所述免疫治疗是施用治疗性或预防性疫苗。还优选这样的操作步骤，籍此所述的益生菌或含益生菌的组合物在给予所述疫苗之前或同时施用。可在施用疫苗之后继续施用所述的益生菌或含益生菌的组合物一段时间。
第十方面，提供适于预防或治疗慢性或急性粘膜表面疾病的药物组合物，其包含有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
优选地所述益生菌是细菌，例如其可选自但不限于，乳酸细菌，分枝杆菌种或双歧杆菌种。更优选的是使用能诱导Th1细胞应答的嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophilus)(L.acidophilus)，发酵乳芽孢杆菌(Lactobacillus fermentum)(L.fermentum)或牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)(M.vaccae)，或其部分。特别优选的是嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)。对于嗜酸乳芽孢杆菌、发酵乳芽孢杆菌(L.fermentum)或牝牛分枝杆菌(M.vaccae)，可应用活的或灭活的制剂，条件是它们能诱导Th1应答。优选嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)和发酵乳芽孢杆菌(L.fermentum)以活制剂的形式使用。可以理解其他细菌也可能适合作为此处定义的益生菌(无论其是否具有益生菌的作用)，例如熟知的佐剂细菌，例如干酪乳芽孢杆菌(L.casei)，植物乳芽孢杆菌(L.plantarum)，鼠李糖乳芽孢杆菌(L.rhamnosus)，短双歧杆菌(Bifidobecterium breve)等。
优选地，所述的药物组合物包括活生物体，但应当理解的是也可以使用被杀死的生物体。而且，单一生物体制剂或包含多种生物体的制剂均是可设想到的。所述的生物体可以是完整的或破裂的。
当所述的益生菌是完整的活益生细菌时，优选的益生菌含量是可递送剂量为约1×108到约1×1012个生物体的量。
优选的组合物制剂是固体剂量形式，例如片剂或胶囊。然而，可以理解的是，其也可以配制成食品的形式，例如基于大豆或乳的产品。
第十一方面，提供预防或治疗粘膜表面与慢性或急性感染、或与非期望的细菌寄居或再活化有关的症状和/或并发症的方法，该方法包括给需要它的对象施用有效量的能非特异地激活共有粘膜系统的药剂。
优选地，所述的有待治疗的症状和/或并发症是慢性疲劳综合征。
优选的所述药剂是益生菌或含益生菌的组合物。还优选所述的益生菌是活的完整生物体，或含益生菌的组合物包含活的完整生物体。
优选地，有待治疗的对象选自EBV阳性的运动员，突发CFS的对象，运动后持久疲劳的对象，具低水平唾液IgA或IgA1的对象，和被证明为患有传染性单核细胞增多症的对象。
图2在用白假丝酵母(Candida albicans)侵染后喂嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophilus)的动物唾液中NO的分泌。
图3在用白假丝酵母(Candida albicans)侵染后，益生菌对IL-12产生的影响。
图4在用白假丝酵母侵染后，益生菌对IL-14产生的影响。
图5喂嗜酸乳芽孢杆菌的动物的抗感染能力。
图6在用白假丝酵母侵染后，益生菌对唾液IFN-γ的影响。
图7在用白假丝酵母侵染后，益生菌对子宫颈淋巴结的影响。
图8用白假丝酵母侵染后的唾液IFN-γ。
图9在小鼠中用L-MLNA进行处理对清除白假丝酵母的影响。
本发明的方法和组合物也可有效地用于治疗急性的和慢性的病毒感染。特别是可以设想到治疗人群中普遍存在的、与多种症状和疾病相关的慢性埃-巴二氏病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)和其他疱疹类病毒感染，这是特别有用的用途。还可以设想到的有用用途是将本发明的方法和组合物用于治疗如下疾病，所述疾病可以起源于群体中流行的病毒感染或由之触发并且其可使人衰弱，但尚无已知的或被充分阐释的治疗方案，例如慢性疲劳综合征(“CFS”)。
目前有相当多被诊断为“CFS”的患者由于粘膜免疫受损表现出反复激活的EBV(或类似的疱疹类病毒感染)。这可通过测定唾液中的IgA1或IFN-y，或通过PCR检测游离病毒进行监测。可能响应益生菌治疗的那些的典型(但非限制性)临床特征包括以“病毒性疾病”开始，留下慢性复发性疲劳状态。急性恶化伴随“感染”(通常以咽喉炎为标志)或过度锻炼出现。
病毒性感染并不一定引起立即可识别的症状，其可以在健康强壮的个体中潜伏相当长时间，但一旦提供引发因素则可以被再次激活。例如，在运动员接受高强度训练或运动时，低粘膜含量的EBV可导致身体机能受损，这将使病毒重新活化并排出，由此又导致机能受损和/或疲劳。因此，EBV阳性并伴有机能受损的运动员，特别是当检测出唾液中的IgA或IgA1水平低时(例如低于50mg/100ml)，接受本发明的制剂进行治疗是有益的。
当然，本发明的制剂和方法也可以用于其他对象，例如被诊断为“CFS”的患者，当病毒(通常为EBV，但也可以是CMV，Ross River病毒等)被再次激活及疲劳尤其是因运动引起时。但是，对于下述的患者接受本发明制剂进行治疗也是有益的，即任何被证实患有传染性单核细胞增多症且几周内没有改善并产生疲劳的患者，和任何在病毒性疾病临床(血清学)迹象出现后产生持久性疲劳的患者，或突发CFS的个体，患复发性咽喉炎的个体，运动后疲劳显著加剧的个体，表现出低水平的唾液IgA或IgA1(例如，低于50mg/100ml)的个体。
可以设想到，施用益生菌或含益生菌的组合物也将有助于治疗与病毒感染相关的上述症状和/或病症。
所述的益生菌对远离益生菌施用位点的粘膜表面可产生作用。因此，广义上说，本发明涉及益生菌产品，特别是属于或包括乳芽孢杆菌的产品，但也可以包括其他细菌或细菌的组合，或实际上其他能够诱导Th-1型细胞应答的佐剂，所述产品可作为大丸剂施用，或优选地有规律地喂食，以便通过致敏粘膜T细胞或维持这些细胞的致敏状态使所有粘膜表面保持最佳的粘膜保护状态。这些T细胞含有IFNγ并能够通过非特异性机制被触发而释放IFN-γ。因此，其他能够非特异地激活共有粘膜系统的药剂也可有利地用于本发明的制剂和方法中。
而且，本发明的益生菌可与其他治疗相结合使用以加强或辅助其效力。例如，近20％接受抗生素治疗幽门螺杆菌(H.pylori)感染的患者无法根除该生物体。这种对抗生素治疗的耐受性可能是由于向Th0应答(即IFN-γ减少，而IL-4增多)的迁移所致。在进行抗生素治疗之前，同时或之后施用益生菌可以是有益的，因为这可使应答转回为更显著的Th1应答，从而补充或辅助抗生素治疗以根除患者体内的该生物体。
因此，施用益生菌可用于阻止或治疗粘膜感染，异常或不适当的生物体在粘膜表面的寄居，和病毒的再激活或再感染。
下面参照非限定性的实施例对本发明进行更具体的描述。
简要地说，24-孔微滴定板的板孔用俘获抗-IL-4抗体包被。在室温下温育1小时后，洗孔并将生物素酰化的抗-IL-4抗体加到每孔中。再温育1小时后，洗孔并向每孔中加入链霉亲和素-过氧化物酶偶联物。温育30分钟后，洗孔并加入TMB底物。在ELISA平板读数器中于450/620nm下读取显示的颜色。在未知的样品中IL-4的水平利用标准曲线通过插值法定量。用类似的步骤测定IFN-γ。
在
图1A和B中显示的结果表明饲喂嗜酸乳芽孢杆菌导致IL-4的产生以剂量依赖方式受到抑制(图1A)而IFN-γ的产生增强(图1B)。
实施例2益生菌对唾液中一氧化氮(NO)分泌的影响如下述实施例3中所述，用嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillusacidophilus)喂DBA/2小鼠(每组n＝3到5)，然后再用白假丝酵母(Candida albicans)侵染上述小鼠。经口注入后在不同时间，注射毛果芸香碱以促进唾液流出，然后收集唾液。依照Gree等的方法((1982)Anal.Biochem 126131-138)通过Griess反应确定唾液中NO的浓度。
数据表明，在喂嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophilus)(经口施用5×109CFU)的动物唾液中NO的分泌量在用白假丝酵母(Candidaalbicans)侵染后早期有显著地升高，但在后期显著地下降(图2)。
实施例3喂食益生细菌后对白假丝酵母(C.albicans)的抗性每两天一次用0.2mL PBS中的5×109个嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)以胃内方式喂DBA/2小鼠H2d雄性小鼠(每组n＝3-5)，共两周。最后一次饲喂后一天，用108个白假丝酵母(Candida albicans)芽生孢子侵染小鼠，所述的侵染是通过细头无菌药签涂抹小鼠口腔而进行的。在感染后的不同天中测定口腔粘膜中的白假丝酵母(C.albicans)数量。口腔(颊，舌和软腭)用细头棉签彻底擦拭。将所述的棉签置于1mLPBS中，用涡旋混和器混合以悬浮酵母细胞，然后于37℃下，在添加了氯霉素的沙氏葡糖琼脂上培养10倍系列稀释物。所得结果以CFU/mL表示(图5)。
与喂食PBS的对照小鼠相比，喂食嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)的小鼠在所有的时间点上均有更强的抗感染性。不迟于第6天，几乎所有的酵母细胞均从喂食了嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)的小鼠中被清除掉。
实施例4IL-4，IFN-γ和IL-12的产生用实施例3中所述的模型进一步研究对白假丝酵母(Candidaalbicans)感染的应答。
通过在MSE Soniprep中超声处理，从新鲜培养的白假丝酵母(Candida albicans)制备假丝酵母抗原。将超声处理物于2000g离心10min，然后收集上清液于PBS中透析。评估蛋白质后，将所述溶液过滤除菌并贮存于-20℃以备需要。
过筛切割子宫颈淋巴结组织以制备子宫颈淋巴结(CLN)细胞的单细胞悬浮物。将所述细胞收集在添加了10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基中，离心洗两次，然后以每孔4×106个细胞在有2.5μg/mL假丝酵母抗原的24-孔培养板上培养3天。
收集培养物上清液，用匹配的抗体对以及作为对照的重组细胞因子(Pharmingen，San Diego，CA)通过ELISA分析IL-4，IL-12和IFN-γ。细胞因子ELISA的灵敏度为31pg/mL，结果以扣除背景后的净量表示。
依实施例2中所述方法获得唾液样品。
IL-4和IL-12研究的结果如图3(IL-12)和图4(IL-4)所示。
IFN-γ的研究结果如图6(唾液的IFN-γ)和7(子宫颈淋巴结IFN-γ)所示。
对照数据表明，仅有很弱的且持继时间不佳的对白假丝酵母(Candida albicans)口腔感染的应答，且直到感染后的第6天也没有检测到IFN-γ。而有关喂食了嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)的小鼠的研究数据表明，在未感染的小鼠中没有IFN-γ应答，但当小鼠受白假丝酵母(C.albicans)侵染后即有早期应答(第2天)，并且与未喂食嗜酸乳芽孢杆菌(L.acidophilus)的对照小鼠相比，其在经白假丝酵母(C.albicans)侵染后有更持久的IFN-γ应答。这一最初效果在第15天于淋巴结中和第8天于唾液中均仍可观察到。
不希望受到任何具体作用机制的约束，但似乎通过施用乳芽孢杆菌可使粘膜表面致敏以在受侵染后分泌IFN-γ，而且在这一模型中IFN-γ起到阻止病原体白假丝酵母(Candida albicans)向真菌的菌丝体(侵袭性)形式转化的作用并加强了细胞免疫和一氧化氮产生。
实施例5.IFN-γ和NO的抗感染作用为确定保护的免疫参数，在白假丝酵母(C.albicans)感染后的不同时间测定IFN-γ水平。如图8所示，与未免疫的小鼠相比，免疫小鼠唾液中IFN-γ水平在经白假丝酵母(C.albicans)侵染后即刻以及侵染后1天明显升高。所述的水平可维持15天以上，与未免疫的小鼠相比，在第10天和第15天检测到显著更高的水平。由于一氧化氮的产生与宿主的寄生感染防御相关，故在两个具有相同H2d MHC单倍型的小鼠品系中定量感染后的NO量。在这一实验中小鼠经白假丝酵母(C.albicans)感染后腹膜内注射NO合酶抑制剂，在三天中每天注射NG-L-精氨酸单甲基一乙酸酯(MNLA)，然后测定酵母的清除速度。如图9所示，在两个小鼠品系中，与未经处理的小鼠相比，在不同的时间点用MNLA处理的小鼠均延迟了清除酵母的时间，这表明NO产生的减少与抗性相关。
实施例6饲喂嗜酸乳芽孢杆菌的大鼠肺中非典型流感嗜血杆菌的清除增加将0.75 mL PBS中的嗜酸乳芽孢杆菌(2.5×1010个每只大鼠)或单独的PBS通过胃内途径喂食DA大鼠(200-250克，8-10周龄，AnimalResource Centre，Perth，WA)，每2天一次共7天，其间所述大鼠通过腔内途径给予福尔马林灭活的流感嗜血杆菌(每只大鼠5×109个)进行免疫(见下组)。继续饲喂大鼠，每2天一次共2周，之后，经气管内途径用50μl福尔马林灭活的流感嗜血杆菌(每只大鼠5×108个)进行加强。继续饲喂嗜酸乳芽孢杆菌7天后，用50μL5×108个活流感嗜血杆菌侵染大鼠肺部。
免疫组(5只大鼠/组)1PBS(腔内)2流感嗜血杆菌(腔内)+流感嗜血杆菌(气管内加强)3PBS(腔内)+嗜酸乳芽孢杆菌(每2天喂一次)4流感嗜血杆菌(腔内)+流感嗜血杆菌(气管内加强)+嗜酸乳芽孢杆菌(每2天喂一次)侵染后4小时处死大鼠，在支气管灌洗液(BAL)和肺匀浆物(LH)中检测肺内的寄居水平。清除水平通过将10倍系列稀释的支气管灌洗液或肺匀浆物接种到巧克力琼脂平板上进行测定。所得结果以菌落形成单位数(CFU)表示。
结果如表1所示。喂嗜酸乳芽孢杆菌并用灭活的流感嗜血杆菌免疫的大鼠对肺部的流感嗜血杆菌感染有更强的抗性。而且，用重复剂量的嗜酸乳芽孢杆菌口服喂养的大鼠比仅用单一嗜酸乳芽孢杆菌大丸剂喂养的大鼠具有更强的抗感染能力，这提示，增强的清除作用有可能是由于重复喂食后嗜酸乳芽孢杆菌在肠道内的寄居增强所致。
表1喂食嗜酸乳芽孢杆菌的大鼠肺部中流感嗜血杆菌的清除增强
实施例7.在用灭活的沙门氏菌疫苗免疫后的小鼠中嗜酸乳芽孢杆菌(VRI 011)对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyhimurium)转移的影响革兰氏阴性细菌穿过肠上皮的转移特别会在经外科手术或胃肠感染后的个体中出现。若不进行治疗可导致内毒素血症。在这一实施例中，检测了喂食嗜酸乳芽孢杆菌对肠道病原体鼠伤寒沙门氏菌转移的影响。
雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，从Animal Resource Centre(Perth，WA)获得。嗜酸乳芽孢杆菌菌株(VRI 011)和病原体鼠伤寒沙门氏菌由the School of Microbiology and Immunology Type Culture Collection，University of New South Wales获得。
在两周的时间内给予小鼠5剂嗜酸乳芽孢杆菌(VRI 011)(每剂1×108cfu)或PBS，此后用灭活的口服沙门氏菌疫苗胃内免疫所述小鼠。免疫后两周将小鼠处死，收集其脾脏以计算嗜酸乳芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的数量。
与喂食PBS的小鼠相比，在口服灭活的沙门氏菌疫苗之前或同时给小鼠喂食嗜酸乳芽孢杆菌(VRI 011)可以更好地阻止口服活细菌侵染后沙门氏菌的转移(表1)。用灭活的口服疫苗免疫降低了鼠伤寒沙门氏菌向脾脏的转移，但喂食嗜酸乳芽孢杆菌可进一步加强这种作用。病原细菌通过肠道上皮的转移可通过口服益生菌予以阻止。
实施例8在经灭活的口服沙门氏菌疫苗免疫的小鼠中发酵乳芽孢杆菌对病原鼠伤寒沙门氏菌从肠道发生转移的影响2周时间内，在施用108个灭活的鼠伤寒沙门氏菌疫苗之前或同时给BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)喂食108个发酵乳芽孢杆菌VRI012(由University of New South Wales，School of Microbiology andImmunology Culture Collection，Sydney，澳在利亚获得)四次。口服施用后两周，以口服途径施用活鼠伤寒沙门氏菌以侵染上述小鼠。将小鼠处死后，测定鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyhimurium)在小鼠脾脏中的寄居水平。表2表明，与喂食PBS的小鼠相比，在施用鼠伤寒沙门氏菌免疫之前或同时喂食发酵乳芽孢杆菌的小鼠中仅出现低水平的转移。表2在经灭活的鼠伤寒沙门氏菌疫苗免疫的小鼠中发酵乳芽孢杆菌VRI012增强对鼠伤寒沙门氏菌转移的抑制
实施例9.发酵乳芽孢杆菌对清除NTHi细菌的影响对6只雌性、无特定病原体的黑刺豚鼠(DA)组成的实验组单次给予PBS或活发酵乳芽孢杆菌(2.5×1010)，所述的给药在通过剖腹手术暴露出肠道后直接注射到十二指肠腔中完成。21天后，用5×108个活的非典型流感嗜血杆菌(NTHi)气管内感染所述的大鼠。4小时后用过量的戊巴比妥处死上述大鼠。其肺脏用10mLPBS灌洗以获得支气管肺泡灌洗液(BAL)。经灌洗的肺脏在10mL PBS中进行组织匀浆。将20ul10倍系列稀释的BAL和肺匀浆物(LH)接种在巧克力琼脂平板上，于10％CO2孵箱中37℃下培养过夜。菌落记数并确定在BAL和LH制品中的活细菌数，以菌落形成单位(CFU)表示回收的活NTHi细菌，如下表3.
*与PBS组相比这些数据表明用发酵乳芽孢杆菌向肠道单次给药可增强对后续急性NTHi呼吸道感染的清除。
实施例10.嗜酸乳芽孢杆菌对幽门螺杆菌的清除的影响通过管饲法连续三天(第1，2和3天)施用约109个活幽门螺杆菌，以幽门螺杆菌(Sydney菌株1)感染两组小鼠，其中每组5只雌性C57BL/6小鼠。在第28，30，32，35，37和39天通过管饲法用嗜酸乳芽孢杆菌(5×109个在0.2 mL水中)或水(对照组)对小鼠给药。
21天(第50天)后用过量的戊巴比妥(腹膜内施用)处死小鼠并取出它们的胃。将胃对半切开，一半置于1mL去离子水中匀浆。将胃匀浆物的10倍系列稀释物接种于含两性霉素，万古霉素，杆菌肽和萘啶酮酸的巧克力琼脂平板上。在37℃微需氧条件下培养3天后，对菌落进行记数，并确定在最初的胃匀浆物中的活幽门螺杆菌总数。从胃中回收到的活幽门螺杆菌的结果以菌落形成单位表示，见下表。
表4
两组有显著的不同(P＝0.013)这些结果表明施用嗜酸乳芽孢杆菌的小鼠比对照组小鼠具有较低水平的胃内幽门螺杆菌感染。这是一个关于嗜酸乳芽孢杆菌对预先建立的幽门螺杆菌(H.pylori)感染的治疗效果的实例。
实施例11在用益生菌预处理的小鼠中对幽门螺杆菌感染的抗细菌治疗(甲硝基羟乙唑)幽门螺杆菌感染的小鼠(每组5只)在用甲硝基羟乙唑(0.08mg/只动物)治疗1周以前，持继2周每周口服3次嗜酸乳芽孢杆菌(每只动物1×109个)。
下述结果表明，与用盐水处理的对照组相比，在下列处理小鼠中观察到胃中的细菌被非常显著地清除掉，所述处理小鼠为用益生菌预处理后用抗生素治疗的小鼠(70％，p＝0.009)，单独用益生菌治疗的小鼠(58％，p＝0.013)，和单独用甲硝基羟乙唑治疗的小鼠(55％，p＝0.025)。
表6
与对照数值相比a，p＜0.01；b，p＜0.02；c，p＜0.005上述实施例阐明，益生细菌可通过驱动特定的细胞因子平衡(来自肠道来源的但于粘膜中重新定位的T细胞)建立一种较不适于特定微生物生长的环境。
尽管本发明参照优选的实施方案进行了描述，但应当理解的是符合本文所述的本发明概念的变化形式也包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.预防或治疗非肠粘膜表面的粘膜表面的慢性或急性感染或非期望的微生物寄居的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的粘膜表面选自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，生殖道的和腺体的粘膜。
3.预防或治疗呼吸道粘膜表面的慢性或急性疾病的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述的粘膜表面是口腔粘膜。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述的粘膜表面是肺粘膜。
6.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌，或含益生菌的组合物被施用于胃或肠粘膜表面。
7.预防或治疗由扰乱细胞因子平衡或缺乏适当的T细胞免疫应答所引起的慢性或急性粘膜表面疾病的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的益生菌或含益生菌的组合物。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述的粘膜表面选自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，肠的，生殖道的和腺体的粘膜表面。
9.如权利要求3-8中任意一项所述的方法，其中，所述的疾病是感染或不适当的微生物寄居。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的感染是由下述一种或多种细菌引起的细菌感染，所述的细菌选自假单胞菌种，链球菌种，葡萄球菌种，假丝酵母种，螺杆菌种和嗜血杆菌种。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述的一种或多种细菌选自非典型的流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌，肺炎链球菌，白色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，白假丝酵母和幽门螺杆菌。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述的疾病是感染或不适当的病毒寄居。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述的病毒选自埃-巴二氏病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，Ross River病毒(RRV)，疱疹类病毒等。
14.如权利要求9或12所述的方法，其中，所述的疾病是慢性疲劳综合征(CFS)。
15.如权利要求7-14中任意一项所述的方法，其中所述的细胞因子是干扰素-γ，白介素-4和/或白介素-12。
16.如权利要求9-15中任意一项所述的方法，其中，所述的适当的T细胞免疫应答是Th1应答。
17.如权利要求1-16中任意一项所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌是，或含益生菌的组合物包含乳芽孢杆菌属或分枝杆菌属种。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌是，或含益生菌的组合物包含嗜酸乳芽孢杆菌、发酵乳芽孢杆菌、干酪乳芽孢杆菌和/或牝牛分枝杆菌。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述的本文中所定义的益生菌，或含益生菌的组合物包括活的生物体。
20.如权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中，所述的有效量在约108到1012CFU的范围内。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的有效量是约1011CFU。
22.如权利要求1-21中任意一项所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物是固体剂型。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述的剂型是片剂或胶囊。
24.如权利要求1-23中任意一项所述的方法，其进一步包括施用一种或多种药学上的活性剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中，一种或多种药学上的活性剂是抗生素。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物在施用一种或多种药学上的活性剂之前，同时或之后施用。
27.如权利要求1-26中任意一项所述的方法，其中所述的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物的施用位点远离有病症的粘膜表面。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌，或含益生菌的组合物被施用于肠粘膜表面以治疗口的，鼻咽的，胃的，呼吸道的，生殖道的或腺体的粘膜感染。
29.改变对象粘膜表面细胞因子平衡的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
30.诱导对象粘膜表面产生Th1细胞免疫应答的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
31.增强对象粘膜表面的干扰素-γ分泌的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
32.降低对象粘膜表面的白介素-4分泌的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
33.恢复对象粘膜表面的正常细胞因子平衡的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
34.致敏粘膜表面以进行免疫治疗的方法，该方法包括向需要它的对象施用有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述的免疫治疗是施用治疗性或预防性的疫苗。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物在施用所述的疫苗之前或同时施用。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中，在施用所述疫苗之后再施用所述的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
38.适用于预防或治疗粘膜表面的慢性或急性疾病的药物组合物，其包含有效量的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其中，所述的本文中所定义的益生菌是，或含益生菌的组合物包含乳芽孢杆菌属或分枝杆菌属种。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中，所述的本文中所定义的益生菌是，或含益生菌的组合物包含嗜酸乳芽孢杆菌，发酵乳芽孢杆菌，干酪乳芽孢杆菌和/或牝牛分枝杆菌。
41.如权利要求38到40中任意一项所述的药物组合物，其中，所述的本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物包括活的生物体。
42.如权利要求38到41中任意一项所述的药物组合物，其中该组合物包含约108到约1012CFU。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中该组合物包含约1011CFU。
44.如权利要求38到43中任意一项所述的药物组合物，其中，所述的药物组合物是固体剂型。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其中，所述的剂型是片剂或胶囊。
46.预防或治疗粘膜表面与慢性或急性感染或非期望的微生物寄居或再活化相关的症状和/或并发症的方法，所述的方法包括给需要它的对象施用有效量的能非特异性激活共有粘膜系统的药剂。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述的症状和/或并发症是慢性疲劳综合征。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中，所述的药剂是本文中所定义的益生菌或含益生菌的组合物。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述的本文中所定义的益生菌是，或含益生菌的组合物包含活的完整生物体。
50.如权利要求46到49中任意一项所述的方法，其中，所述对象选自EBV阳性的运动员，突发CFS的对象，运动后持久疲劳的对象，具低水平唾液IgA或IgA1的对象和被证明为患有传染性单核细胞增多症的对象。
全文摘要
本发明涉及通过尤其是利用益生菌，如乳芽孢杆菌或牝牛分枝杆菌增强非特异性的粘膜免疫，用于治疗或预防与粘膜表面相关的疾病，特别是治疗粘膜处感染性病症的方法和组合物。
文档编号A61P31/10GK1444484SQ01813439
公开日2003年9月24日 申请日期2001年6月19日 优先权日2000年6月19日
发明者R·克兰西, G·派恩, T·博罗蒂, M·邓克利, P·L·康韦 申请人:穆科普罗泰科有限公司