一种汞离子的快速检测方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种汞离子的快速检测方法及检测试剂盒。本发明将DNA支点介导的链置换反应技术与试纸条检测技术相结合，建立一种用于快速可视化的汞离子检测方法和检测试剂盒。本发明的检测方法可在室温下完成整个反应过程，达到快速检测的目的，对汞离子的检测限为1nM，且具有很好的特异性，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便，可用于汞离子的实地现场检测。
【专利说明】一种汞离子的快速检测方法及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学【技术领域】，涉及一种DNA支点介导的链置换反应用于汞离子的快速检测。
【背景技术】 [0002]汞离子(Hg2+)是一种具有严重生理毒性的重金属离子，对人体危害严重，是环境监测的重要指标。由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤、生殖系统损伤等。美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量不得超过ΙΟηΜ。目前己报道的检测汞离子的方法主要有原子发射光谱、原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法等。然而这些方法通常需要昂贵的仪器以及复杂的操作，严重制约了这些方法的广泛应用。因此，开发操作简便、选择性好、灵敏度高且成本低廉的汞离子检测方法具有非常重要的意义。汞离子能够与DNA中的胸腺嘧啶(thymine，T)特异性地结合，在DNA的T-T错配中可形成 T-Hg2+-T 复合物(Tanaka, Y.；0da, S.;Yamaguchi, H.；Kondo, Y.；Kojima, C and Ono,A.J.Am.Chem.Soc.,2007,129，244-245)。基于这一特点，有报道了荧光法、比色法、电化学方法以及电化学发光法用于汞离子的检测。但是这些方法都需要使用检测仪器来读取检测数据，难以用于实地现场快速检测。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术中所存在的不足，本发明旨在将DNA支点介导的链置换反应技术与试纸条检测技术相结合，建立一种用于快速可视化的汞离子检测方法和检测试剂盒。
[0004]本发明所采取的技术方案是:
[0005]一种汞离子的快速检测方法，包括如下步骤:
[0006]I)构建茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T碱基；
[0007]2)构建辅助DNA:所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构；
[0008]3)将待检样品和圣环结构DNA、辅助DNA混合后，静直反应，在有萊尚子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构；
[0009]4)通过检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开来判断待检样品中是否含有汞离子。
[0010]作为优选的，所述茎环结构DNA中，DNA支点的碱基数为5~10个碱基。
[0011]作为优选的，所述DNA支点中含有I~5个T碱基。
[0012]作为优选的，所述茎环结构DNA中，环状区的碱基数为9~12，茎状区的碱基数为18~21个,?状区的碱基数比环状区的碱基数多。[0013]在汞离子存在的情况下，所述辅助DNA与茎环结构DNA的DNA支点以及DNA支点一侧的茎状区互补。
[0014]所述方法的步骤4)可采用荧光法、电化学方法、比色法、电化学发光法或试纸条法来检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开。
[0015]作为优选的，步骤4)采用试纸条法检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开，所述试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
[0016]所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补；
[0017]所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；
[0018]所述质控区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
[0019]一种汞离子快速检测试剂盒，其包括:
[0020]1)茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T喊基；
[0021]2)辅助DNA:所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构，形成部分互补的双链DNA ；
[0022]3)检测试纸条。
[0023]所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
[0024]所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补；
[0025]所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；
[0026]所述质控区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
[0027]所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰；所述DNA探针3用链霉亲和素和生物素修饰。
[0028]下面举例介绍一下本发明方法的技术原理:
[0029]如图1所示，茎环结构DNA包含有4个功能区域，分别是1、2、3和2*区域，其中2和2*是互补的,构成莖环结构的莖状区；3为莖环结构的环状区；1区域可以作为DNA支点，用于启动DNA链置换反应。在I区域中含有I~5个T碱基。
[0030]辅助DNA包含有2个区域(I*和2*)，其中在区域I*中也含有I~5个T碱基。在有Hg2+存在时，茎环结构DNA的DNA支点的I区域通过形成T-Hg2+-T复合物与辅助DNA的I*区域结合,从而开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构,使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA (I*和I互补，2*和2互补)。此时,茎环结构DNA被打开，形成部分双链DNA结构,而且茎环结构DNA的3区域和2*区域被暴露在外。可采用荧光法、电化学方法、比色法、电化学发光法或试纸条法来检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开，下面介绍其中的试纸条法。
[0031]如图2所示，检测试纸条包含4个部分:样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，这四个部分从左到右依次固定于胶板上。DNA探针I(DNAprobel)用巯基(-SH)修饰，固定在金纳米颗粒(AuNPs)上，形成的AuNPs-DNA probel复合物喷射在金标垫上。硝酸纤维素膜上划有两个检测区域:检测区和质控区，其中检测区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探针2 (SA-biotin-DNAprobe2)，质控区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin) -DNA 探针 3 (SA-biotin-DNA probe3)。其中 DNA 探针 I 的 3* IX域与上述部分双链DNA的3区域是互补的:DNA探针2的2区域与h沭部分双链DNA的2*区域是互补的；DNA探针3与DNA探针I互补。
[0032]将部分双链DNA滴于试纸条的样品垫上，通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时，部分双链DNA的3区域与DNA probel的3*区域杂交，形成复合物。该复合物继续往前移动，通过检测区时，部分双链DNA的2*区域会与固定在检测区的SA-biotin-DNApr0be2相互作用，从而抓住该复合物，使其在检测区聚集。聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的AuNPs-DNAprobel复合物会与质控区上的DNA探针3杂交，在质控区聚集，从而质控区也呈红色。也就是说有汞离子存在时候，检测区和质控区都显示红色。当没有汞离子存在时，茎环结构DNA和辅助DNA不会相互作用，无法启动DNA支点介导的链置换反应，因而没有部分互补的双链DNA形成，茎环结构DNA的2*区域没有暴露出来，无法被检测区的DNA探针2捕获，从而检测区没有红色出现，而质控区始终显示红色，表明组装的试纸条可用。
[0033]本发明的有益效果是:
[0034](I)本发明的检测方法具有较高的灵敏度，对汞离子的检测限为InM，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便，可用于汞离子的实地现场检测；
[0035](2)本发明所述的汞离子检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；
[0036](3)本发明的检测方法，可在室温下完成整个反应过程，达到快速检测的目的；试纸条使用起来省时、省力，检测速度快`且操作简单方便，不需要使用任何仪器，不需要专业的技术人员，无须培训即可推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为DNA支点介导的链置换反应示意图；
[0038]图2为试纸条检测示意图；
[0039]图3为对不同浓度的汞离子检测的结果图；
[0040]图4为特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0042]实施例1
[0043]一种基于DNA支点介导的链置换反的汞离子快速检测试剂盒的构建
[0044]一、茎环结构DNA与辅助DNA的设计
[0045]茎环结构DNA的序列如SEQ ID NO:1所示,其结构如下:
[0046]AGTCTAGGATTCGGCGTG GGTTAAGACACA CACGCCGAATCCTAGACT
[0047]2*3 2[0048]ACTTTTCG
[0049]I
[0050]其中，其中2和2*是互补的，构成茎环结构的茎状区；3为茎环结构的环状区；1区域可以作为DNA支点，用于启动DNA链置换反应。
[0051]辅助DNA的序列如SEQ ID NO:2所示，结构如下:
[0052]CGTTAAGT AGTCTAGGATTCGGCGTG
[0053]I*2*
[0054]辅助DNA的I*区域通过形成T-Hg2+-T复合物与茎环结构DNA的DNA支点I区域结合，从而开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA。
[0055]二、试纸条的设计及组装
[0056]下面试纸条所用到的DNA探针的序列如表1所示。
[0057]表1
[0058]
【权利要求】
1.一种汞离子的快速检测方法，包括如下步骤: 1)构建茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T喊基； 2)构建辅助DNA:所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构； 3)将待检样品和茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构； 4)通过检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开来判断待检样品中是否含有汞离子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述茎环结构DNA中，DNA支点的碱基数为5~10个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述DNA支点中含有I~5个T喊基。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述茎环结构DNA中，环状区的碱基数为9~12,?状区 的碱基数为18~21个,?状区的碱基数比环状区的碱基数多。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在汞离子存在的情况下，所述辅助DNA与茎环结构DNA的DNA支点以及DNA支点一侧的茎状区互补。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4)可采用荧光法、电化学方法、比色法、电化学发光法或试纸条法来检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开。
7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，步骤4)采用试纸条法检测茎环结构DNA的茎环结构是否被打开，所述试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸； 所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补； 所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补； 所述质控区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
8.一种汞离子快速检测试剂盒，其包括: 1)茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的一端适当延伸，用作DNA支点，DNA支点中含有T碱基； 2)辅助DNA:所述辅助DNA的一端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的DNA支点端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA的茎环结构，形成部分互补的双链DNA ； 3)检测试纸条。
9.根据权利要求8所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸； 所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补； 所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的茎状区互补；所述质控区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
10.根据权利要求8所述的快速检测试剂盒，其特征在于，所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素 修饰；所述DNA探针3用链霉亲和素和生物素修饰。
【文档编号】C12Q1/68GK103773855SQ201410005084
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】陈俊华, 周顺桂, 温俊林 申请人:广东省生态环境与土壤研究所