一种同时检测待测溶液中汞离子和铅离子的含量的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时检测待测溶液中汞离子和铅离子的含量的方法。

背景技术：

重金属污染严重威胁人类健康和生态环境安全，已成为一个世界范围的环境问题。铅离子(Pb²⁺)和汞离子(Hg²⁺)污染是我国常见的重金属污染，具有毒性大、致毒剂量低、易累积、难降解、难治理等特点，因而是目前环境监测和治理的重点。

为控制铅离子和汞离子经摄入进入人体内，《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中Hg²⁺的浓度不能高于0.001mg/L，Pb²⁺浓度不能高于0.01mg/L，并基于原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体质谱(ICP/MS)等仪器开发了检测痕量Pb²⁺和Hg²⁺的标准方法(如GB/T 20380.1-2006、GB/T 23362.4-2009)。尽管标准的仪器方法检测饮用水中Pb²⁺和Hg²⁺具有灵敏、准确等优点，但也存在着样品前处理复杂、仪器设备昂贵、检测时间长等问题，难以实现快速现场检测或对突发水污染事件做出快速响应。

近年来，基于功能核酸(Functional Nucleic Acids，FNAs)方法检测环境中重金属离子展现出巨大的应用潜力，目前已开发了大量基于FNAs检测Pb²⁺和Hg²⁺的方法。其中对于Hg²⁺检测常用的核酸为MSO(Mercury Specific Oligonucleotide)，其主要功能是在Hg²⁺作用下，DNA中的T碱基可以形成错配；而对于Pb²⁺的检测主要使用G-四连体(G-quartet，G4)或者8-17/GR-5DNAzyme，在铅离子的作用下，G4催化ABTS^2－的能力被抑制，而8-17/GR-5DNAzyme则可以将其部分互补的底物链切断；其中GR-5DNAzyme是新近发现的仅对Pb²⁺有特异响应的DNAzyme，性能优于传统8-17DNAzyme。上述研究均仅侧重于单一重金属离子快速检测方法，实际应用中往往伴有多种重金属离子的超标释放，可见，寻找一种既可检测汞离子又可检测铅离子的方法势在必行。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何检测待测溶液中汞离子或铅离子的含量。

为解决上述技术问题，本发明提供了检测待测溶液中汞离子或铅离子的含量的方法，该方法以对铅离子的响应的GR-5DNAzyme为基础，在其中引入了对Hg²⁺有特异响应的DNA序列，经重新设计和优化出对Hg²⁺和Pb²⁺均能响应的DNA序列：Hg-Pb TD，Hg-Pb TD由酶链Hg-Pb TD-En和底物链Hg-Pb TD-Sub组成。该方法的原理：当加入Hg²⁺和Pb²⁺后，原杂交结合的酶链Hg-Pb TD-En与底物链Hg-Pb TD-Sub发生去杂交，根据去杂交的程度可检测相应的离子浓度。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测待测溶液中汞离子的含量的方法。

本发明提供的检测待测溶液中汞离子的含量的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)：

所述步骤(a)包括如下步骤：

(a-1)杂交液和铅离子屏蔽剂混匀，孵育；

(a-2)完成步骤(a-1)后，加入待测溶液，孵育；

(a-3)完成步骤(a-2)后，采用Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(b)包括如下步骤：

(b-1)所述杂交液和汞离子标准溶液混匀，孵育；

(b-2)完成步骤(b-1)后，采用所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(c)：根据所述汞离子标准溶液中汞离子的浓度和相应荧光信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(a-3)得到的荧光信号强度代入所述标准曲线，得到待测溶液中汞离子的含量。

上述方法中，所述杂交液可含有底物链Hg-Pb TD-Sub和酶链Hg-Pb TD-En。

上述方法中，所述底物链Hg-Pb TD-Sub可为单链核酸分子，自3’末端到5’末端依次可包括如下元件：S1片段、S2片段和S3片段。所述S1片段可由n1个T组成。所述S2片段的核苷酸序列可为AAGGrA，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸。所述S3片段可由n2个T组成。所述底物链Hg-Pb TD-Sub的末端可具有荧光猝灭基团。n1和n2均为大于等于12且小于等于18的自然数。n1>n2。所述底物链Hg-Pb TD-Sub的末端具体可为所述底物链Hg-Pb TD-Sub的5’末端。所述荧光猝灭基团可为荧光淬灭基团BHQ2、荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ1或荧光淬灭基团BHQ3。

上述方法中，所述酶链Hg-Pb TD-En可为单链核酸分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：E1片段、E2片段和E3片段。所述E1片段可由n3个A组成。所述E2片段的核苷酸序列可为TGAAGTAGCGCCGCCGT。所述E3片段可由n4个A组成。所述酶链Hg-Pb TD-En的末端可具有荧光基团。n3和n4均为大于等于12且小于等于18的自然数。n3>n4。所述酶链Hg-Pb TD-En的末端具体可为所述酶链Hg-Pb TD-En的3’末端。所述荧光基团可为花青素荧光染料Cy3、羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy5或花青素荧光染料Cy5.5。

上述方法中，所述Hg-Pb TD-PS探针可为单链核酸分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：P1片段和P2片段。所述P1片段可由n5个脱氧核糖核苷酸组成，且不能与所述酶链Hg-Pb TD-En和所述底物链Hg-Pb TD-Sub进行杂交。所述P2片段可由n6个T组成。n5和n6均为大于等于12且小于等于16的自然数。所述Hg-Pb TD-PS探针的末端可具有修饰基团。所述Hg-Pb TD-PS探针的末端具体可为所述Hg-Pb TD-PS探针的5’末端。所述修饰基团可为NH₂-(CH₂)₁₂。所述修饰基团可使所述Hg-Pb TD-PS探针和传感光纤进行连接。

上述方法中，n1＝n3。n2＝n4＝n6。优选为n1＝n3＝18。优选为n2＝n4＝n6＝12。优选为n5＝15。

上述方法中，A为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。T为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。G为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸。C为胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。

上述方法中，“采用Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度”可为采用所述Hg-Pb TD-PS探针通过与脱落的带荧光标记的杂交后，通过仪器激发荧光标记并检测荧光信号强度。“采用Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度”具体可为采用具有所述Hg-Pb TD-PS探针的全光纤倏逝波生物传感器检测荧光信号强度。所述全光纤倏逝波生物传感器可按照中国专利号为200610089497.4、授权公告号为CN 1873450B的发明专利的实施例制备。

上述方法中，所述杂交液可由所述酶链Hg-Pb TD-En和所述底物链Hg-Pb TD-Sub组成。所述底物链Hg-Pb TD-Sub可由所述S1片段、所述S2片段和所述S3片段组成。所述酶链Hg-Pb TD-En可由所述E1片段、所述E2片段和所述E3片段组成。所述Hg-Pb TD-PS探针可由所述P1片段和所述P2片段组成。

上述方法中，所述底物链Hg-Pb TD-Sub的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述酶链Hg-Pb TD-En的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述Hg-Pb TD-PS探针的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述铅离子屏蔽剂具体可为PDCA。所述PDCA具体可为Sigma-Aldrich公司的产品。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测溶液中铅离子的含量的方法。

本发明所提供的检测待测溶液中铅离子的含量的方法，可包括步骤(A)、步骤(B)和步骤(C)：

所述步骤(A)可包括如下步骤：

(A-1)上述任一所述杂交液和汞离子屏蔽剂混匀，孵育；

(A-2)完成步骤(A-1)后，加入待测溶液，孵育；

(A-3)完成步骤(A-2)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(B)可包括如下步骤：

(B-1)上述任一所述杂交液和铅离子标准溶液混匀，孵育；

(B-2)完成步骤(B-1)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(C)：根据所述铅离子标准溶液中铅离子的浓度和相应荧光信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(A-3)得到的荧光信号强度代入所述标准曲线，得到待测溶液中铅离子的含量。

所述汞离子屏蔽剂可为Hg²⁺屏蔽序列。所述Hg²⁺屏蔽序列具体可由10个T组成；T为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。

上述任一所述的方法中，所述待测溶液可为待测液相样本。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测溶液中汞离子或铅离子含量的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述任一所述底物链Hg-Pb TD-Sub和上述任一所述酶链Hg-Pb TD-En。

上述试剂盒中，还可包括上述任一所述Hg-Pb TD-PS探针。

上述任一所述试剂盒中，还可包括光纤探头。

上述任一所述试剂盒中，还可包括表面具有上述任一所述Hg-Pb TD-PS探针的光纤探头。

上述任一所述试剂盒中，还可包括全光纤倏逝波生物传感器。

上述任一所述试剂盒中，还可包括汞离子屏蔽剂。所述汞离子屏蔽剂可为Hg²⁺屏蔽序列。所述Hg²⁺屏蔽序列具体可由10个T组成；T为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。

上述任一所述试剂盒中，还可包括铅离子屏蔽剂。所述铅离子屏蔽剂具体可为PDCA。所述PDCA具体可为Sigma-Aldrich公司的产品。

上述任一所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。

上述任一所述试剂盒在检测待测溶液中汞离子或铅离子含量中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测溶液中汞离子的含量的方法。

本发明所提供的检测待测溶液中汞离子的含量的方法，可包括步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)：

所述步骤(1)可包括如下步骤：

(1-1)上述任一所述杂交液和待测溶液混匀，孵育；

(1-2)完成步骤(1-1)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(2)包括如下步骤：

(2-1)上述任一所述杂交液和汞离子标准溶液混匀，孵育；

(2-2)完成步骤(2-1)后，采用所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(3)：根据所述汞离子标准溶液中汞离子的浓度和相应荧光信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(1-2)得到的荧光信号强度代入所述标准曲线，得到待测溶液中汞离子的含量。

上述方法中，所述待测溶液为不含有铅离子的待测液相样本。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测溶液中铅离子的含量的方法。

本发明所提供的检测待测溶液中铅离子的含量的方法，可包括步骤(d)、步骤(e)和步骤(f)：

所述步骤(d)可包括如下步骤：

(d-1)上述任一所述杂交液和待测溶液混匀，孵育；

(d-2)完成步骤(d-1)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(e)包括如下步骤：

(e-1)上述任一所述杂交液和铅离子标准溶液混匀，孵育；

(e-2)完成步骤(e-1)后，采用所述Hg-Pb TD-PS探针检测荧光信号强度；

所述步骤(f)：根据所述铅离子标准溶液中铅离子的浓度和相应荧光信号强度绘制标准曲线，将所述步骤(e-2)得到的荧光信号强度代入所述标准曲线，得到待测溶液中铅离子的含量。

上述方法中，所述待测溶液为不含有汞离子的待测液相样本。

上文中，所述汞离子具体可为Hg²⁺。所述铅离子具体可为Pb²⁺。

上述任一所述铅离子标准溶液可为溶液1、溶液2、溶液3、溶液4或溶液5。具体制备方法如下：取Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀释，依次获得Pb²⁺浓度为0nM的溶液1、Pb²⁺浓度为16.7nM的溶液2、Pb²⁺浓度为167nM的溶液3、Pb²⁺浓度为833nM的溶液4和Pb²⁺浓度为1670nM的溶液5。所述Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)可为国家有色金属及电子材料分析测试中心的产品。

上述任一所述汞离子标准溶液可为溶液a、溶液b、溶液c、溶液d或溶液e。具体制备方法如下：取Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀释，依次获得Hg²⁺浓度为0nM的溶液a、Hg²⁺浓度为16.7nM的溶液b、Hg²⁺浓度为167nM的溶液c、Hg²⁺浓度为833nM的溶液d或Hg²⁺浓度为1670nM的溶液e。所述Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)可为国家有色金属及电子材料分析测试中心的产品。

如果欲检测待测溶液汞离子和铅离子的总含量，可按照所述方法检测待测溶液中的汞离子的含量和铅离子的含量，然后将二者相加，即得到待测溶液汞离子和铅离子的总含量。

实验证明，本发明所提供的方法，既可检测汞离子的含量，又可检测铅离子的含量，且检测准确率高、灵敏度高、选择性好和重复性好。因此，本发明所提供的方法在检测汞离子的含量和检测铅离子的含量中的具有重要的应用价值。

附图说明

图1为不同浓度Pb²⁺溶液的检测结果图。

A为不同浓度Pb²⁺溶液的实际检测图；B为Pb²⁺检测的标准曲线图。

图2为不同浓度Hg²⁺溶液的检测结果图。

A为不同浓度Hg²⁺溶液的实际检测图；B为Hg²⁺检测的标准曲线图。

图3为对不同金属离子的选择性检测结果图。

A为Pb²⁺溶液检测时对不同离子的选择性；B为Hg²⁺溶液检测时对不同离子的选择性。

图4为对浓度为167nM的Hg²⁺溶液的重复性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的全光纤倏逝波生物传感器按照中国专利号为200610089497.4、授权公告号为CN 1873450B的发明专利的实施例制备。

2，6-pyridinedicarboxylic acid(PDCA)为Sigma-Aldrich公司的产品；在作为铅离子屏蔽剂。3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为sigma-aldrich公司的产品，CAS号为919-30-2。传感光纤为南京春辉科技实业有限公司的产品，产品型号为HCS。

硫酸-过氧化氢溶液由98.3％(质量百分含量)的浓硫酸水溶液和30％(质量百分含量)的过氧化氢水溶液按体积比3:1混合而成。

硅烷化剂溶液：将2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶于100mL脱水甲苯，得到硅烷化剂溶液。

戊二醛偶联剂溶液：将戊二醛溶于pH7.4、50mM的Tris-HAc缓冲液得到戊二醛偶联剂溶液；戊二醛偶联剂溶液中，戊二醛的体积百分含量为2％。

Hg-Pb TD-PS探针、酶链Hg-Pb TD-En和底物链Hg-Pb TD-Sub均为单链核酸分子，由宝生物工程(大连)有限公司合成。Hg-Pb TD-PS探针、酶链Hg-Pb TD-En和底物链Hg-Pb TD-Sub的核苷酸序列见表1。

表1

注：Cy3为花青素荧光染料，rA为腺嘌呤RNA，BHQ2为荧光淬灭基团。

Hg-Pb TD-PS探针溶液：将Hg-Pb TD-PS探针和NaNO₃溶于pH7.4、50mM的Tris-HAc缓冲液，得到Hg-Pb TD-PS探针溶液；Hg-Pb TD-PS探针溶液中，Hg-Pb TD-PS探针的浓度为150nM，NaNO₃的浓度为100mM。

Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液：将酶链Hg-Pb TD-En、底物链Hg-Pb TD-Sub和NaNO₃溶于pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液，得到Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液；Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液中，酶链Hg-Pb TD-En和底物链Hg-Pb TD-Sub的浓度均为30nM，NaNO₃的浓度为50mM。

Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)为国家有色金属及电子材料分析测试中心的产品，Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)中Pb²⁺浓度为1000μg/mL。

Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)为国家有色金属及电子材料分析测试中心的产品，Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)中Hg²⁺浓度为1000μg/mL。

实施例1、Pb²⁺和/或Hg²⁺的检测方法

GR-5DNAzyme是新近发现的仅对Pb²⁺有特异响应的DNAzyme，性能优于传统8-17DNAzyme，其中GR-5DNAzyme由酶链GR-5En和底物链GR-5Sub组成。为可以检测Pb²⁺和/或Hg²⁺，需对GR-5DNAzyme的结构进行重新设计。经过大量设计和实验操作验证，本发明的发明人发现需保留其关键位置脱氧核酸的组成和结构，即保留其对Pb²⁺有响应的结构；还需通过在底物链GR-5Sub上“AAGGrA”的两端分别加上若干个T碱基(一般为12-18个)，使Hg²⁺加入后，底物链可以从酶链上离去，从而建立Hg²⁺浓度和荧光强度的关系，鉴于此重新设计和优化出对Hg²⁺和Pb²⁺均能响应的DNA序列：Hg-Pb TD，Hg-Pb TD由酶链Hg-Pb TD-En和底物链Hg-Pb TD-Sub组成。该方法的原理：当加入Hg²⁺和Pb²⁺后，原杂交结合的酶链Hg-Pb TD-En与底物链Hg-Pb TD-Sub发生去杂交，根据去杂交的程度可检测相应的离子浓度。

建立的Pb²⁺含量和/或Hg²⁺含量的检测方法，具体步骤如下：

一、制备Hg-Pb TD-PS探针光纤

1、表面羟基活化的传感光纤的制备

(1)将传感光纤浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，80℃静置1h。

(2)完成步骤(1)后，取所述传感光纤，用超纯水冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，然后用氮气吹干，120℃静置3h，即获得表面羟基活化的传感光纤。

2、表面硅烷化的传感光纤的制备

(1)将表面羟基活化的传感光纤浸泡于硅烷化剂溶液中，室温(如25℃)静置120min。

(2)完成步骤(1)后，取所述表面羟基活化的传感光纤，先用脱水甲苯冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，再用无水乙醇冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，然后用氮气吹干，180℃烘烤1h，即获得表面硅烷化的传感光纤。

3、表面偶联化的传感光纤的制备

(1)将表面硅烷化的传感光纤浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温(如25℃)静置60min。

(2)完成步骤(1)后，取所述表面硅烷化的传感光纤，先用超纯水冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，再用pH7.4、50mM的Tris-HAc缓冲液冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，然后用氮气吹干，得到表面偶联化的传感光纤。

4、Hg-Pb TD-PS探针光纤的制备

(1)取表面偶联化的传感光纤，在其表面均匀覆盖Hg-Pb TD-PS探针溶液，然后放入湿度为65％(实际应用中湿度为55％-75％之间均可)的密闭环境中室温(如25℃)静置18h。

(2)完成步骤(1)后，取所述表面偶联化的传感光纤，先用0.2％(质量百分含量)的SDS水溶液冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，再用超纯水冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，然后用20μM的甘氨酸水溶液浸泡处理1h。

(3)完成步骤(2)后，取所述表面偶联化的传感光纤，先用0.2％(质量百分含量)的SDS水溶液冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，再用超纯水冲洗3次(每次冲洗时间为1min)，然后用氮气吹干，得到固定Hg-Pb TD-PS探针的传感光纤，命名为Hg-Pb TD-PS探针光纤。

二、不含Hg²⁺的待测样品中的Pb²⁺含量的检测

不含Hg²⁺的待测样品中的Pb²⁺含量的检测的步骤如下：

1、将Hg-Pb TD-PS探针光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

2、取Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀释，依次获得Pb²⁺浓度为16.7nM的溶液2、Pb²⁺浓度为167nM的溶液3、Pb²⁺浓度为833nM的溶液4和Pb²⁺浓度为1670nM的溶液5。将0.1M硝酸水溶液做为溶液1(Pb²⁺浓度为0nM)。

3、完成步骤2后，向试管中先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液，然后加入3μL溶液(溶液1、溶液2、溶液3、溶液4或溶液5)，室温(如30℃)静置8min，得到杂交后的溶液。

4、完成步骤3后，取杂交后的溶液，通入完成步骤1的全光纤倏逝波生物传感器，进行Pb²⁺检测，将不同时间产生的荧光信号进行收集，然后利用最强荧光信号值计算荧光强度百分比。考虑到Pb²⁺与Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液的反应时间，完成单次检测的全过程需少于15min。

完成上述步骤后的Hg-Pb TD-PS探针光纤可以再生，再生方法为：将完成上述步骤后的Hg-Pb TD-PS探针光纤先用饱和尿素水溶液洗涤2次(每次洗涤时间为48s)，然后用0.2％(质量百分含量)的SDS水溶液冲洗2次(每次洗涤时间为48s，最后使用超纯水和pH7.4、10mM的Tris-HAc缓冲液各清洗一遍，洗涤时间均为24s。

实验结果见图1中A。结果表明，随着Pb²⁺浓度的增加，荧光信号值逐渐增大。

5、以Pb²⁺浓度为横坐标，荧光强度百分比为纵坐标，绘制检测Pb²⁺的标准曲线。

检测Pb²⁺的标准曲线如图1中B所示，线性关系为：Y＝0.031X+46.08，R²＝0.9916。

根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，Pb²⁺的最低检测限为10nM。

6、不含Hg²⁺的待测样品中的Pb²⁺含量的检测

按照上述步骤1至4，将步骤3中的溶液替换为不含Hg²⁺的待测样品，其它步骤均不变，得到不含Hg²⁺的待测样品的荧光强度百分比；然后根据检测Pb²⁺的标准曲线即可计算得出不含Hg²⁺的待测样品中的Pb²⁺含量。

三、不含Pb²⁺的待测样品中的Hg²⁺含量的检测

不含Pb²⁺的待测样品中的Hg²⁺含量的检测的步骤如下：

1、将Hg-Pb TD-PS探针光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

2、取Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀释，依次获得Hg²⁺浓度为16.7nM的溶液b、Hg²⁺浓度为167nM的溶液c、Hg²⁺浓度为833nM的溶液d和Hg²⁺浓度为1670nM的溶液e。将0.1M硝酸水溶液做为溶液a(Hg²⁺浓度为0nM)。

3、完成步骤2后，取试管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液，然后加入3μL溶液(溶液a、溶液b、溶液c、溶液d或溶液e)，室温(如30℃)静置8min，得到杂交后的溶液。

4、完成步骤2后，取杂交后的溶液，通入完成步骤1的全光纤倏逝波生物传感器，进行Hg²⁺检测，将不同时间产生的荧光信号进行收集，然后利用最强荧光信号值计算荧光强度百分比。考虑到Hg²⁺与Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液的反应时间，完成单次检测的全过程需少于15min。

完成上述步骤后的Hg-Pb TD-PS探针光纤可以再生，具体方法同步骤二中Hg-Pb TD-PS探针光纤的再生方法。

实验结果见图2中A。结果表明，随着Hg²⁺浓度的增加，荧光信号值逐渐增大。

5、以Hg²⁺浓度为横坐标，荧光强度百分比为纵坐标，绘制检测Hg²⁺的标准曲线。

检测Hg²⁺的标准曲线如图2中B所示，线性关系为：Y＝0.029X+50.67，R²＝0.9942。

根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，Hg²⁺的最低检测限为7nM。

6、不含Pb²⁺的待测样品中的Hg²⁺含量的检测

按照上述步骤1至4，将步骤3中的溶液替换为不含Pb²⁺的待测样品，其它步骤均不变，得到不含Pb²⁺的待测样品的荧光强度百分比；然后根据检测Hg²⁺的标准曲线即可计算得出不含Pb²⁺的待测样品中的Hg²⁺含量。

四、含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量的检测

A、含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量的检测的原理为：使用Hg²⁺屏蔽序列掩蔽含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中的Hg²⁺，然后再检测Pb²⁺含量。含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Hg²⁺的浓度不超过1670nM。

含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量的检测的步骤如下：

1、按照步骤二中1－5的方法，制备检测Pb²⁺的标准曲线。

2、将Hg-Pb TD-PS探针光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

3、取试管，加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液，然后加入Hg²⁺屏蔽序列，得到混合液；混合液中，Hg²⁺屏蔽序列的浓度为30nM。

4、完成步骤3后，取混合液，静置5min，然后加入含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品，室温(如30℃)静置8min，得到杂交后的溶液。

5、完成步骤4后，取杂交后的溶液，通入完成步骤2的全光纤倏逝波生物传感器，进行Pb²⁺检测，得到荧光强度百分比；然后根据检测Pb²⁺的标准曲线即可计算得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量。

B、检测待测溶液

1、用丹江口水库的水样配制0.1M硝酸水溶液。

2、完成步骤1后，取Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用步骤1配制的0.1M硝酸水溶液稀释，获得Pb²⁺浓度为1000nM的待测溶液。

3、完成步骤2后，按照步骤A中的方法检测待测溶液中Pb²⁺的含量。

4、完成步骤2后，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液中Pb²⁺的含量。

实验结果表明，按照步骤A中的方法检测待测溶液中Pb²⁺的含量为967±45nM，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液中Pb²⁺的含量为1027±0.085nM，两种方法检测结果基本一致，因此，本发明所提供的方法可准确的检测待测样品中Pb²⁺的含量。

五、含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Hg²⁺含量的检测

A、含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Hg²⁺含量的检测的原理为：使用PDCA掩蔽含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中的Pb²⁺，然后再检测Hg²⁺含量。含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺的浓度不超过1670nM。

含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Hg²⁺含量的检测的步骤如下：

1、按照步骤三中1－5的方法，制备检测Hg²⁺的标准曲线。

2、将Hg-Pb TD-PS探针光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

3、取试管，加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液，然后加入PDCA，得到混合液；混合液中，PDCA的浓度为10mM。

4、完成步骤3后，取混合液，静置5min，然后加入含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品，室温(如30℃)静置8min，得到杂交后的溶液。

5、完成步骤4后，取杂交后的溶液，通入完成步骤2的全光纤倏逝波生物传感器，进行Hg²⁺检测，得到荧光强度百分比；然后根据检测Hg²⁺的标准曲线即可计算得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Hg²⁺含量。

B、检测待测溶液

1、用丹江口水库的水样配制0.1M硝酸水溶液。

2、完成步骤1后，取Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用步骤1配制的0.1M硝酸水溶液稀释，获得获得Hg²⁺浓度为100nM的待测溶液。

3、完成步骤2后，按照步骤A中的方法检测待测溶液中Hg²⁺的含量。

4、完成步骤2后，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液中Hg²⁺的含量。

实验结果表明，按照步骤A中的方法检测待测溶液中Hg²⁺的含量为94±22nM，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液中Hg²⁺的含量为104±0.018nM，两种方法检测结果基本一致，因此，本发明所提供的方法可准确的检测待测样品中Hg²⁺含量。

六、含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量和Hg²⁺含量的检测

A、含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量和Hg²⁺含量的检测的步骤如下：

1、按照步骤四的方法，得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Pb²⁺含量。

2、按照步骤五的方法，得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待测样品中Hg²⁺含量。

B、检测待测溶液

1、用丹江口水库的水样配制0.1M硝酸水溶液。

2、完成步骤1后，取Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用步骤1配制的0.1M硝酸水溶液稀释，获得Pb²⁺浓度为1000nM的待测溶液1。取Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用步骤1配制的0.1M硝酸水溶液稀释，获得获得Hg²⁺浓度为100nM的待测溶液2。

3、完成步骤2后，按照步骤A中1的方法检测待测溶液1中Pb²⁺的含量，按照步骤A中2的方法检测待测溶液2中Hg²⁺的含量。

4、完成步骤2后，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液1中Pb²⁺的含量，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液2中Hg²⁺的含量。

实验结果表明，按照步骤A中1的方法检测待测溶液1中Pb²⁺的含量为986±47nM，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液1中Pb²⁺的含量为1031±0.076nM，两种方法的检测结果基本一致；按照步骤A中2的方法检测待测溶液2中Hg²⁺的含量为102±23nM，采用电感耦合等离子质谱检测待测溶液2中Hg²⁺的含量为105±0.016nM，两种方法的检测结果基本一致。因此，本发明所提供的方法可准确的检测待测样品中Pb²⁺含量和Hg²⁺含量。

实施例2、选择性检测

一、制备Hg-Pb TD-PS探针光纤

同实施例1步骤一。

二、不同金属离子的选择性检测

1、将Hg-Pb TD-PS探针光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

2、取试管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液，然后加入3μL溶液(1mM硝酸亚铁水溶液、1mM硝酸锰水溶液、1mM硝酸铝水溶液，1mM硝酸铁水溶液，1mM硝酸银水溶液，1mM氯化镉水溶液，1mM硝酸铜水溶液，1mM硝酸钴水溶液，1mM硝酸铅水溶液，1mM硝酸镁水溶液和1mM硝酸钙水溶液、100μM草酸铅水溶液或100μM草酸汞水溶液)，室温(如30℃)静置8min，得到杂交后的溶液。

3、完成步骤2后，取杂交后的溶液，通入完成步骤1的全光纤倏逝波生物传感器，检测对不同金属离子的选择性实验结果，具体方法为：收集荧光信号，利用最强荧光信号值计算百分比信号值，百分比信号值的计算公式如下：

百分比信号值(％)＝(待测金属离子的荧光信号值/1.67μM Pb²⁺或1.67μM Hg²⁺)的最强荧光信号值)×100％。

实验结果见图3。结果表明，Fe²⁺离子、Mn²⁺离子、Al³⁺离子、Fe³⁺离子、Ag⁺离子、Cd²⁺离子、Cu²⁺离子、Co²⁺离子、Zn²⁺离子、Mg²⁺离子和Ca²⁺离子相对于Pb²⁺离子或Hg²⁺离子的百分比信号值均小于5％，干扰性可以忽略。因此，本发明所提供的方法对于Pb²⁺或Hg²⁺的检测均具有良好的选择性。

实施例3、重复性检测

一、制备Hg-Pb TD-PS探针光纤

同实施例1步骤一。

二、Hg-Pb TD-PS探针光纤的重复性检测

1、将Hg-Pb TD-PS探针光纤装入全光纤倏逝波生物传感器。

2、取试管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub杂交液，然后加入3μL Hg²⁺浓度为167nM的溶液c(用0.1M硝酸水溶液稀释Hg²⁺标准溶液(GSB O4-1729-2004)得到)，室温(如30℃)静置8min，得到杂交后的溶液。

3、完成步骤2后，取杂交后的溶液，通入完成步骤1的全光纤倏逝波生物传感器，进行Hg-Pb TD-PS探针光纤对Hg²⁺的重复性检测，共进行5次检测。将不同时间产生的荧光信号进行收集，利用最强荧光信号值计算百分比信号值，百分比信号值的计算公式如下：

百分比信号值(％)＝(待测金属离子的荧光信号值/1.67μM Pb²⁺或1.67μM Hg²⁺)的最强荧光信号值)×100％。

实验见图4。结果表明，Hg-Pb TD-PS探针光纤对Hg²⁺检测的重复性好。

按照上述步骤，将步骤2中Hg²⁺浓度为167nM的溶液c替换为Pb²⁺浓度为167nM的溶液3(用0.1M硝酸水溶液稀释Pb²⁺标准溶液(GSB O4-1742-2004)得到)，其它步骤均不变，得到Hg-Pb TD-PS探针光纤对Pb²⁺的重复性检测。结果表明，Hg-Pb TD-PS探针光纤对Pb²⁺检测的重复性好。

上述实验结果表明，本发明所提供的方法对于Pb²⁺或Hg²⁺的检测的重复性较好。