离子的检测试剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属有机合成和分析化学领域，具体地说是一种NCV离子的检测试剂及应 用。
【背景技术】
[0002] 阴离子在生物和环境系统中扮演着重要角色。例如，硝酸根离子可使人体正常的 血红蛋白氧化而失去运输氧的能力，还可与仲胺类化合物反应生成具有致癌性亚硝胺类化 合物。根据报道每升水中硝酸盐含量达数十毫克时，可能导致婴儿患高铁血红蛋白症的几 率增加。因而对硝酸根离子的测定具有重要的实际意义。目前测定硝酸根离子的方法有多 波长法、二阶导数法、流动注射法、离子色谱法、极谱法等。荧光光谱法由于操作简单，检测 灵敏和较低的检测限，以及无需昂贵仪器设备等优点而受到越来越多的关注。但是，目前大 多数的荧光探针只能用于金属离子的检测，用于阴离子检测的荧光试剂尤其是能应用到水 环境的探针很少。这主要是因为阴离子一般存在于水环境中，而阴离子在水溶液中会形成 很强的氢键，所以检测水溶液中的阴离子是非常困难的。因此，发展以特定阴离子为识别测 定对象的荧光探针分子具有重要研宄意义和实际应用价值。
[0003]另一方面，荧光探针与荧光显微技术的结合，使荧光探针在生物活性物质检测和 细胞成像方面得到广泛应用。例如，美国加州大学戴维斯分校（UCDavis)生物光子学科学 技术中心（CBST)的科研人员首次通过荧光标记成功地对活肿瘤细胞内部的纳米尺寸区室 的运动进行了成像。这一成果为未来理解癌症和一大批其他疾病的分子原因和生物力学 的突破进展带来了希望，它还促进了神经科学和干细胞等领域的研宄。荧光成像分析是目 前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。另一方面，由于阴离子在生命 活动和环境治理等方面的重要价值，如何检测和识别阴离子的研宄是科研工作者的热点之 一。尤其是阴离子参与调控细胞的诸多功能与性质，在细胞内起着非常重要的作用，因此， 实现活体细胞内各种阴离子生理活性小分子物种的实时在线动态检测对生命科学研宄与 发展具有重要的价值。然而，由于阴离子具有较高的溶剂化自由能以及较大的离子半径，到 目前为止，真正能够应用到环境或活细胞内阴离子荧光成像的荧光探针不多。本专利申请 首次报道了一种能检测中性水溶液中微量NCV离子的荧光探针并将其应用于活体细胞内 NO,阴离子荧光成像。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于研宄一种能高灵敏、高选择性检测pH值中性水溶液中微量 NO,的荧光光谱分析新方法并将其应用于活性细胞内NCV阴离子荧光成像。本发明的目的 通过发明人研制合成的新的荧光试剂，采用增强荧光光谱强度法对NCV离子进行荧光光谱 分析。
[0005] -种NCV离子检测试剂，其特征是其化学结构式为a:
分子式：C44H54Br2N2;分子量：770. 72 在水溶液中的荧光激发波长是470nm，最大发射波长是640nm，荧光强度很弱，与NOf离子结合后，最大发射波长是575nm，焚光强度明显增强，可用于NOf离子的检测。
[0006] 上述的一种NCV离子的检测试剂，是指所述探针a的制备方法为以9, 10-双吡啶 基乙烯蒽为原料，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，与溴代辛烷烃反应，合成路线如下：
核磁共振氢谱：虫NMR(DMS0-d6，500MHz)J: 9. 06 (d,岁5Hz,，4H)，8. 95 (d， ^15Hz, 2H), 8. 51(d, ^5Hz, 4H), 8. 41 (m, , 4H), 7. 63 (m, , 4H), 7. 28 (d, ^15 Hz, 2H), 4. 55 (t, ^20Hz, 4H), 1. 93 (t,岁20Hz, 4H), 1. 93 (m, 20H), 0? 83 (m, 6H)。
[0007] 所述的一种N(V离子检测试剂的应用，是指用于检测中性水溶液中微量NO^离子 的焚光光谱分析。
[0008] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，是指用于水溶液中微量N0，离子的定性或 定量分析，定量分析的线性浓度范围1. 5X1(T7~2. 1X1(T5mol吨4;定性分析检测限低至 10 8mol?L\
[0009] 所述的一种NCV离子检测试剂的应用，是指其它阴离子F'Cl、Br、HSCV，S042' Ac0_，BF4_，H2P04_在浓度与NO3_浓度相当时，不干扰N03_的测定。
[0010] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，是指用于对活体细胞内NO离子染色后的 荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
[0011] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，所指的细胞为活体的PC3细胞。
[0012] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，所指的细胞为活体PC3人体前列腺癌细胞。
[0013] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，是指用探针a对细胞内N0 ^进行染色，用荧 光倒置显微镜观测活体细胞，染色成像的具体方法为：活性PC3细胞经复苏接种于含10%胎 牛血清以及含1%双抗的培养基（RPMI1640)中，在温度为37°C，5%C02及饱和湿度为100% 的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养， 密度为2X104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入含5ymol?厂1探针a (900yL培养基 + 100ymol?L-1 探针a的CH30H/H20 混合溶液 100yL)中，在 37°C，5% C02、饱和湿度100%的培养箱中孵育30min，吸出含探针a的培养液，用新鲜培养基清洗细 胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；再浸入含20ymol?I71NCV溶液 (900yL培养基 + 500ymol.I71NO,溶液lOOyL)，在 37°C、5%C02、饱和湿度 100% 的 培养箱中孵育30min，进行细胞内探针对NCV染色，吸出含NCV溶液的培养液，染色后的细 胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内NCV染色后的荧光成 像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。
[0014] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，是指细胞成像中，探针a和N0，都能渗透到 活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，未见细胞凋亡，对细 胞无毒性；探针与NCV在细胞内染色后，荧光倒置显微镜检测显示了清晰的黄色荧光细胞 分布，染色具有特定区域的选择性聚集能力。
[0015] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，是指所用的试剂为分析纯或生化试剂，所 用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备 为荧光倒置显微镜。
[0016] 上述的一种NCV离子检测试剂的应用，满足了（1)良好的水溶性；（2)在生理条件 下具有良好的热稳定性；（3)良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；（4)对NCV具有选择 性、高灵敏的荧光增强作用，有较长的激发波长和较高的发光产率。利用探针a在活体细胞 内与NO,的染色作用，用荧光倒置显微镜能清晰获得发射黄色荧光的细胞图像。发明了一 种新颖的活体细胞内的荧光成像技术。
[0017]发明效果：本发明用于pH值中性水溶中微量NO,离子的定性和定量分析，定量分 析的浓度线性范围宽为1.5X10_7~2. 1X10_5mol?L-1，检测限低至10_8mol?L-1，同时， 其它阴离子F_，Cl_，Br_，HS04_，S0广，Ac0_，BF4_，H2P04_在浓度相当时不干扰测定。此外， 荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。因此发现对 NO,阴离子活体细胞内荧光成像的方法具有较强的科学研宄意义和实际应用价值。本发明 首次报道了在生理条件下，利用荧光成像技术观察活体细胞内NCV阴离子聚集情况。在细 胞成像中，探针a和N0 ^都能渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆滑饱满状，探针与细胞具有 良好的相容性，未见细胞凋亡，对细胞无毒性；探针与NCV在细胞内染色后，荧光倒置显微 镜检测显示了清晰的黄色荧光细胞分布，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像，染色 具有特定区域的选择性聚集能力。
【附图说明】
[0018] 图1荧光探针a的晶体结构。
[0019] 图2荧光探针a的核磁共振氢谱 图3荧光探针a(1. 00X10 _5mol?I71)的水溶液在不同阴离子（1. 00X10_54mol?I71)F_，Cl_，Br_，HS04_，S042_，Ac0_，BF4_，H2P04_存在下的荧光光谱。N03_ 的加入使a在 575nm 处的荧光强度增强。而其他上述实验阴离子的加入，，几乎不会改变a的荧光强度。测试的 激发波长为470nm。
[0020] 图4其它阴离子对探针a检测NO3_的荧光强度影响。在浓度为1. 00X1(T5mol七1 的a的水溶液中，加入2. 00X10 _4mol吨―1的N0 3_后测定a在波长为575nm处的荧光强度 值。再分别向a-N03_混合溶液中加入等量的其他阴离子：F_，Cl_，&_，HS04_，S0广，Ac0_， BFpH2P(V后的荧光强度值的变化。表明其它实验阴离子没有引起a-NO,体系荧光强度 的变化。测试的激发波长为470nm。
[0021] 图5 365nm紫外灯照射下浓度为1. 00X1(T5mol?r1荧光分子a的水溶液中加入 10倍不同阴离子后的颜色变化。
[0022] 图6不同浓度的N0 3_对探针a的荧光滴定光谱图。在浓度为1. 00X1(T5mol?I71 试剂a的水溶液中分别加入不同浓度NO3_到a溶液中，随着NO3_的加入，分别测得的荧光光 谱。在575nm处的发射峰逐渐升高。测试的激发波长为360nm。
[0023] 图7探针a的荧光光谱法检测NO，的校准曲线。纵坐标为发射波长为575nm处 的荧光强度值，横坐标为NO,的浓度。激发波长为470nm。NO,响应的浓度线性范围为 1. 5X1(T7~2. 1X1(T5mol?L'
[0024] 图8探针a与NO3_对PC3细胞的荧光倒置显微镜拍摄照片。
[0025] 8-1为PC3细胞内只有探针a(浓度为5ymol?I71)时的亮场显