专利名称：镁离子调控的新型表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种受镁离子调控的表达载体。
背景技术：
大肠杆菌的原核表达系统是目前基因工程研究中应用最为广泛的一种蛋白表达手段，它具有基因操作简单，宿主菌株和质粒选择面广，细菌易于生长和控制等特点。pET系列是常用的一种原核表达系统，它通过调节T7RNA聚合酶的表达来控制T7启动子的活性，该系统转录功能强大，但同时存在需外源添加诱导剂，短时间内高效表达易形成包涵体的缺点。该问题也在其它原核表达系统中存在。因此，一种能自我诱导表达目的基因的原核载体有待研究和开发。
发明内容
为了解决pET系列原核表达系统存在需外源添加诱导剂，短时间内高效表达易形成包涵体的不足，本发明的目的是提供一种能自我诱导表达目的基因的原核载体。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现一种镁离子调控的表达载体，其特征在于，该载体为pYS，它含有镁离子(Mg2+)运输蛋白基因mgtC/B的启动子序列(Pmgt)。
一种受镁离子调控的重组质粒载体，其特征在于，待表达的基因被整合进上述受镁离子调控的表达载体pYS中。
本发明的表达载体经实验验证利用红色荧光蛋白(DsRed-Express)基因作为报告分子，结果发现在大肠杆菌中Pmgt仅在培养基中Mg2+耗尽后开始启动报告基因的表达，而外源添加Mg2+后Pmgt的启动子活性则被有效抑制。这说明通过改变培养基中Mg2+的浓度来控制目的基因的表达成为可能，利用培养基中Mg2+自然耗尽的情况下自动诱导表达目的基因将会在一定程度上简化原核表达的操作。在Mg2+自然耗尽的情况下Pmgt的活性渐进式提高，目的产物也是逐步积累(图2a)，这将有助于避免表达产物在短时间内迅速聚集形成包涵体。
本发明的有益效果体现在将鼠伤寒沙门氏菌Mg2+运输蛋白基因mgtC/B的启动子Pmgt应用于大肠杆菌原核表达系统的优化，构建了一种受培养基中Mg2+浓度调控的，无需外源添加诱导剂的通用型原核表达质粒pYS，为大肠杆菌原核表达系统的改进和发展提供了新的方法。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的镁离子调控型原核表达质粒图谱；图2是鼠伤寒沙门氏菌Pmgt在大肠杆菌中的诱导活性；具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
质粒和菌株质粒pDsRed-Express购自美国BD Biosciences Clontech公司，pET-30a(+)和pGEM-T载体分别购自Novagen和Promega公司。鼠伤寒沙门氏菌X4550(Cya-Crp-Asd-R+M+)为美国Washington大学Dr.Roy Curtiss惠赠，本室保存，并向公众发布20年。大肠杆菌DH5α购自深圳晶美生物公司。
试剂和仪器Pfu DNA聚合酶，dNTP，卡那霉素(美国Promega公司)；T4 DNA连接酶和凝胶DNA回收试剂盒(美国Roche公司)，Wizard Plus DNA抽提试剂盒(美国Promega公司)。用超纯水配制成LB液体培养基(每升含tryptone 10g，yeast extract 5g，NaCl 10g，pH7.2)。AAS 300原子吸收光谱分析仪(美国Perkin Elmer公司)，UV240型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，流式细胞仪FACSCalibur(美国Becton-Dickson公司)。
实施例1鼠伤寒沙门氏菌Pmgt的克隆及其在大肠杆菌中的诱导活性质粒的构建采用引物P1、P2从鼠伤寒沙门氏菌X4550基因组中扩增出长约600bp的片段，连入pGEM-T载体，测序证实与GenBank中鼠伤寒沙门氏菌的Pmgt[序列号M57715]完全相同。然后用限制性内切酶Bst1107 I和Xba I切下Pmgt装入相同酶切的pET-30a(+)载体，新质粒命名为pYS，它去除了原先载体中的lac I基因和T7启动子序列。用Nco I和EcoR I切下质粒pDsRed-Express上的DsRed基因装入pYS的相应位点构建pYS-DsRed(图1)。(P15’-GTATACTCCGGAGCAAACGCCTGAACTCCC-3’[Bst1107 I]，P25’-AGATCTGGAAGAATAAGTACGTGCTATATTTAG-3’[Xba I])Pmgt诱导活性测定试验将pYS-DsRed转化进大肠杆菌DH5α。将重组菌单菌落接种5ml LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素，添加或不添加镁离子)，37℃220r/min震摇培养，在不同时间段测定600nm波长处菌液的吸光度和原子吸收光谱测定Mg2+的浓度，并同时吸取100μl样品，PBS洗涤两次后，用流式细胞仪测定细菌的荧光强度(FL-2 channel)。
结果显示在LB液体培养基中，DH5α(pYS-DsRed)进入对数期(1-2小时)后开始表达红色荧光蛋白，并随着培养时间的延长表达量增大，在重组菌进入对数后期(＞8小时)后达到最大(图2a)。同步进行的Mg2+浓度监测显示红色荧光蛋白的表达与培养基中Mg2+的耗尽相一致(图2a)，这提示Mg2+的缺乏诱发了Pmgt的启动。
为进一步证实Mg2+在Pmgt调控中的作用，我们测试Pmgt的活性能否被外源Mg2+抑制。图2b显示在添加10mmol/L的MgCl2LB液体培养基中，红色荧光蛋白的表达被完全抑制。
以上结果说明鼠伤寒沙门氏菌Mg2+运输蛋白基因mgtC/B的启动子Pmgt的活性在大肠杆菌中受外源Mg2+浓度的调控，与在鼠伤寒沙门氏菌中的结果一致。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
权利要求
1.一种镁离子调控的表达载体，其特征是，该载体为pYS，它含有镁离子运输蛋白基因mgtC/B的启动子序列。
2.一种重组质粒载体，其特征在于，待表达的基因被整合进权利要求1所说的镁离子调控的表达载体中。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种受镁离子调控的新型表达载体。所说的镁离子调控的表达载体，其特征在于，该载体为pYS，它含有镁离子运输蛋白基因mgtC/B的启动子序列Pmgt。本发明构建的表达载体受培养基中Mg
文档编号C12N15/70GK101045934SQ20071002057
公开日2007年10月3日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者焦新安, 张晓明, 潘志明, 黄金林, 孙林, 殷月兰, 唐丽华, 刘秀梵 申请人:扬州大学