专利名称：人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品的制作方法
技术领域：
人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。
背景技术：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640119-128)。David S.Park等构建的HalfHSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N一连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU_HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，198537161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，分子量17.9KD～21.8KD，专一性地刺激粒细胞的生成，增强机体的抵抗力。体内外研究显示G-CSF能刺激中性粒细胞增殖和分化，加速粒细胞生成；当感染时，可促进中性粒细胞向炎症部位移动，增强其对病原微生物的吞噬和杀伤力；加强中性粒细胞抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，增强抗肿瘤能力；活化单核巨噬细胞功能。临床上已证实G-CSF具有减轻化疗后自细胞减少或促进其再生，减少感染的危险，增强杀伤癌细胞的效果。但是，天然的或基因重组的G-CSF在人体内的循环半衰期都非常短，只有1.3～4.2小时，需要每日一次静脉注射G-CSF 0.3～60μg/kg，生物利用度低，而且持续给药会引发药疹、发热、肌痛、骨痛等副作用，增加了病人的痛苦，给临床应用带来很大的限制，导致实际用量远低于理论上需要用量。为了克服上述缺点，可以对G-CSF加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有做成缓释剂型、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段将其与其它大分子蛋白融合。本发明将把G-CSF和HSA进行融合表达，通过研发人G-CSF的长效化技术，改善G-CSF体内药代动力学性状，研发出一种具有自主知识产权的长效新药。
发明内容
本发明的目的是提供一种人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人粒细胞集落刺激因子的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
本发明的技术方案从新鲜人外周血中分离单核淋巴细胞，刺激培养，提取RNA，通过RT-PCR反转录得到G-CSF cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和G-CSF cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-GCSF cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；HSA-GCSF cDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-GCSF cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中。
G-CSF cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA和G-CSF cDNA融合基因的克隆，融合蛋白HSA-GCSF的重组酵母构建和融合蛋白HSA-GCSF的表达的步骤详见实施例。
用上述方法制备的人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
优选的是所述融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少95％序列同源的第二区。
所述融合蛋白的第一区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、或经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名为HSA(1-n)，n为369-419。
所述融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人粒细胞集落刺激因子氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
宿主系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等。优选的宿主系统是酵母。优选的酵母是毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
本发明的另一内容是提供表达融合蛋白编码区的宿主。
由于G-CSF基因含有内含子，从新鲜人外周血中分离单核淋巴细胞，刺激培养，提取RNA，通过RT-PCR反转录得到G-CSF cDNA。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。获得的G-CSF cDNA和HSA cDNA分别插入到克隆载体中，测序。利用重叠PCR技术，连接G-CSF cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的G-CSF cDNA和HSA cDNA融合体插入到克隆载体中保存。
G-CSF cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞内型表达载体主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOX1启动子、MFα分泌信号肽和G418抗性基因(可作为筛选重组子的标记)等元件。AOX1启动子是一个强启动子，可以高效的启动目的基因的表达。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶AOX1和AOX2，细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇为唯一碳源培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的30％以上。AOX2与AOX1的同源性虽然高达97％，但酶活很低。当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，细胞在甲醇为唯一碳源的培养基上生长很慢。
带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转化宿主系统。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导表达后用HSA抗体和/或G-CSF抗体检测培养液上清。
本发明的有益效果利用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和G-CSF cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的问题。
优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
可以通过培养带有本发明构建的DNA的宿主系统，来生产本发明的融合蛋白。宿主系统培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一阶段主要用于宿主系统生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。
图1.质粒pPIC9-HSA-GCSF构建。
图2.融合蛋白基因的琼脂糖电泳分析。Lane1DNA Mark；Lane2PCR产物。
图3.融合蛋白的SDS-PAGE分析。Lane1蛋白质Mark；Lane2HSA-GCSF。
图4.融合蛋白的HSA抗体检测。Lane1蛋白质Mark；Lane2HSA-GCSF。
具体实施方法实施例1G-CSF cDNA的克隆以反转录PCR得到的G-CSF cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出G-CSFcDNA，所用的引物如下p15’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p25’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，G-CSFcDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-GCSF，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-GCSF。
实施例2HSA cDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为PH15’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue2KSP分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HAS。
实施例3HSA cDNA和G-CSF cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下PH1 5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’PH25’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次。
G-CSF cDNA的PCR扩增，所用引物如下P35’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P45’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-GCSF 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次。
利用重叠PCR融合G-CSFcDNA和HSA cDNA将G-CSF的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以4∶6比例混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃充分变性5分钟，60.5℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.3kb的目标条带，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml 100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR和EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA-GCSF，阳性重组子命名为XL-1/pBlue-HSA-GCSF。
实施例4HSA-GCSF重组酵母表达系统构建及融合蛋白的表达HSA/G-CSF的重组酵母构建取一支冻存的XL-1/pBlue-HSA-GCSF，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，提取的质粒pBlue-HSA-GCSF和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收。取双酶切后纯化好的pBlue-HSA-GCSF片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取若干个长出的菌落，接种于20ml氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC9-HSA-GCSF，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9-HSA-GCSF；提取DH5αt/pPIC9-HSA-GCSF中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，转化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培养6天。每块平板上用2ml水洗涤，收集洗涤液。取部分收集到的洗涤液，分别涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培养3～6天。挑取在最高浓度G418的YPD平板上的长出菌落，接种于20mlMD培养基中，30℃培养24小时，用常规方法提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC9-HSA-GCSF。
HSA-GCSF融合蛋白的表达将KM71/pPIC9-HSA-GCSF接种至装有100mlBMGY(100mM磷酸钾，pH6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm值为2～6，离心收集菌体。将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY(100mM磷酸钾，pH 6.0、1.34％无氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％(V/V)，诱导3天。离心收集上清，过滤除菌，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-GCSF分子的G-CSF的免疫源性。
用NFS-60细胞/MTT比色法测定上清中的融合蛋白HSA-GCSF活性(2005年版中国药典附录X E重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性测定法)。将传代培养的NFS-60白血病细胞系细胞用RPMI-1640培养基离心洗涤3次将细胞以2×105个/ml密度悬浮于含5％马血清、5％小牛血清的不含G-CSF的RPMI-1640培养基中。于96孔培养板中每孔加入50μl细胞悬液，设6复孔培养，除空白对照孔外，每孔加入不同浓度的待测样品。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养40～48h后每孔加入MTT溶液20μl，再继续培养5h，每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。活性分析结果证明产物具有G-CSF的免疫学活性。Western杂交表明产物具有G-CSF和HSA的免疫源性。
权利要求
1.人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法，其特征是从新鲜人外周血中分离单核淋巴细胞，刺激培养，提取RNA，通过RT-PCR反转录得到G-CSF cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和G-CSF cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-GCSF cDNA融合基因插入到克隆载体，HSA-GCSF cDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-GCSF cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中；(1)G-CSF cDNA的克隆以反转录PCR得到的G-CSF cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出G-CSFcDNA，所用的引物如下p15’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p25’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，G-CSFcDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-GCSF，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-GCSF；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为PH15’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlue分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA；(3)HSA cDNA和G-CSF cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下P15’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P25’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；G-CSF cDNA的PCR扩增，所用引物如下P35’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P45’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下50μl的反应体系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-GCSF 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合G-CSF cDNA和HSA cDNA将G-CSF的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以4∶6比例混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为95℃变性5分钟，60.5℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.3kb的目标条带，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，取双酶切后纯化好的pBlue-HSA-GCSF片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜；连接产物转化大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml 100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA-GCSF，阳性重组子命名为XL-1/pBlue-HSA-GCSF；(4)融合蛋白HSA-GCSF的重组酵母构建取一支冻存的XL-1/pBlue-HSA-GCSF，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，提取的质粒pBlue-HSA-GCSF和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取长出菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC9-HSA-GCSF，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9-HSA-GCSF；提取DH5α/pPIC9-HSA-GCSF中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC9-HSA-GCSF；(5)融合蛋白HSA-GCSF的表达将KM71/pPIC9-HSA-GCSF接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至体积百分终浓度0.5％，诱导3天，离心收集上清，用NFS-60细胞/MTT比色法测定上清中的融合蛋白HSA-GCSF活性，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-GCSF分子的G-CSF的免疫源性。
2.用权利要求1所述方法制备的人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征是包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人粒细胞集落刺激因子同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
3.根据权利要求2所述的人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少95％序列同源的第二区。
4.根据权利要求2所述的人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第一区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。
5.根据权利要求2所述的人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人粒细胞集落刺激因子氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
6.根据权利要求5所述的人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是宿主系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞表达系统。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是优选的宿主系统是酵母。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是优选的酵母是毕赤酵母。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。
全文摘要
人血清白蛋白与人粒细胞集落刺激因子的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将HSA基因cDNA和G－CSF cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的HSA－GCSF cDNA融合基因在宿主系统中进行表达，融合基因被整合到宿主的染色体中；本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人粒细胞集落刺激因子的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
文档编号C12N1/19GK101037477SQ20071002003
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月8日 优先权日2007年2月8日
发明者金坚, 张莲芬, 徐钰, 许正宏, 雷楗勇, 窦文芳, 史仲平 申请人:江南大学