专利名称：人源肝星状细胞激活相关蛋白治疗肝脏疾病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人源肝星状细胞激活相关蛋白的医药用途，即其可以用于治疗肝脏疾病的用途。
背景技术：
肝星状细胞激活相关蛋白(Stellate cell activation-associated protein STAP)是在大鼠肝脏蛋白质组学研究中发现的，与肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)激活密切相关的蛋白。在HSC激活过程中它有明显的上调表达(见Biol Chem.2001，276(27)25318-25323)。通过同源比对，在人的肝脏基因组中又发现了人源肝星状细胞激活相关蛋白(human Stellate cell activation-associated protein hSTAP)，其核苷酸序列参见GENEBANK中的AB057769。免疫组化研究显示，hSTAP的mRNA在人的脑、心脏、肝脏、肾脏等组织细胞中都有不同程度的表达(见Biochim Biophys Acta.2002，1577471-475)。但hSTAP的治疗功能未见文献报道。
目前认为，HSC在肝纤维化发生发展中起主导作用。正常肝脏中HSC处于静息状态，增殖活性很低，肝损伤及各种慢性肝病时HSC被激活，表型发生改变由静息细胞转变为移行细胞，然后转分化肌成纤维样母细胞，合成和分泌细胞外基质(ECM)上调，同时合成和释放大量基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使间质胶原酶等蛋白酶活性降低，ECM降解减少，最终导致ECM积聚而发生肝纤维化乃至肝硬化。肝星状细胞活化是肝纤维化形成的关键。
国内外学者对肝纤维化的可逆性已无异议。鉴于HSC在肝纤维化发病机制中的主导作用，大多数抗肝纤维化研究都以HSC为靶标。通过对抗氧化应激，抑制炎症反应，调节相关细胞因子的活性，干扰细胞因子信号转导等途径抑制HSC增殖、活化，诱导HSC凋亡，均可呈现良好的抗肝纤维化效应。
大量基础和临床研究都显示反应性氧(ROS)和细胞膜的脂质过氧化与肝纤维化发生有关，这表明氧应激是不同病因慢性肝病共同的发病因素。有研究从基因水平证实脂质过氧化可刺激HSC合成I型胶原，而且细胞色素P450 2E1来源的氧化物可促进HSC的增殖和胶原的合成。最近有研究表明，黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的ROS能促进HSC的增殖，此促进作用与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的激活和表达有关，而且在大鼠肺和皮肤成纤维细胞以及心肌成纤维细胞中也发现氧应激可调节MMP-2的表达。由此认为，氧应激和脂质过氧化可通过不同的机制促进HSC的增殖。
发明内容
发明人对hSTAP进行了重组表达，建立了rhSTAP的制备方法，鉴定了rhSTA的一级结构，研究了rhSTAP的抗氧化活性以及对氧化损伤的肝星状细胞的保护作用。结果显示rhSTAP具有抗氧化的生物活性，并且对Fe-NTA造成的肝星状细胞的氧化损伤具有保护作用，并通过缓解Fe-NTA对肝星状细胞造成的氧化损伤，抑制了肝星状细胞的氧化应激反应，从而抑制了HSC的活化。因此，它具有防治肝脏疾病的功能，特别可用于防治肝硬化和肝纤维化。
本发明通过RT-RCP的方法获得hSTAP的cDNA；选择合适的载体，高效表达重组人源肝星状细胞激活相关蛋白(recombinant human Stellate cell activation-associated proteinrhSTAP)；建立rhSTAP分离、纯化、复性的方法；研究rhSTAP的生物活性及对氧化应激的肝星状细胞的保护作用。
hSTAP cDNA的获取方法，其步骤是1、设计PCR引物primer 1(5’-GTCCATGGAGAAAGTGCCAGGCGAGA，NcoI site is underlined)and primer 2(5’-CTAAGCTTCTACGGCCCCGAAAGGG，HindIII site is underlined)；2、提取Hep G2细胞的总RNA，利用RT-PCR的方法，获得rhSTAP的cDNA，见图1；3、PCR条件(94℃1分钟；60℃；1分钟；72℃1分钟；30个循环)。
rhSTAP高效表达方法的建立，其步骤是1、将hSTAP cDNA经过NcoI、HindIII酶切，克隆到载体pET-28a的表达区，构建载体pET-28a-hSTAP；2、转化到宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达。
3、摇瓶筛选表达水平最高的菌株保存菌种。
4、利用5L自动发酵罐进行表达，LB培养基，接种量1％，溶氧量30％，()D达到0.6添加IPTG(作用浓度1mM/L)，培养6h，离心收集菌体，SDS-PAGE电泳检测表达水平，见图2。
结果显示rhSTAP获得了高效的表达，占菌体总蛋白的30％以上。
rhSTAP的制备方法，其步骤是1、rhSTAP以包含体的方式存在。在4℃，5000rpm离心15min收集菌体，然后重悬于缓冲液I中(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl and 0.1％ Triton X-100)；2、菌体利用超声波进行破碎，4℃，15000rpm离心15min收集包含体沉淀；
3、包含体用缓冲液I重悬、洗涤3次；4、然后用溶解液(20mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，20mM DTT，8M urea)溶解6小时以上；4℃，15000rpm离心15min收集上清液；5、将上清液在Sephadex G-25层析柱中复性与纯化，上柱量小于10％柱床体积，用缓冲液II(20mM Tris-HCl，pH8.0)进行洗脱，流速8cm/h；6、UV280nm紫外检测，收集第一个洗脱峰；7、洗脱液经SDS-PAGE检测，保存于4℃(一周以内)或冻干保存。
8、检测复性后的rhSTAP的生物稳定性见表1表1.复性后rhSTAP稳定性的检验
结果显示，采用该制备方法，rhSTAP的收率可以达到100mg/L培养基，纯度大于90％，复性后具有生物活性且性质稳定。
rhSTAP一级结构的鉴定方法，其步骤是1、复性后的rhSTAP利用Resource RPC柱(Global)进行反向质谱纯化，流动相为A液(2％乙腈，0.05％三氟乙酸)、B液(98％乙腈，0.05％三氟乙酸)，利用质谱仪AKTA explorer(Pharmacia Biotech)进行洗脱、收集和结果分析，见图3。
2、rhSTAP的分子量利用MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry)检测，见图4。
3、rhSTAP的N-terminal氨基酸序列利用仪器Protein N-terminal Sequencer(ABI491LCPE).用HPLC的方法检测，见图5。
4、rhSTAP的C-terminal氨基酸序列利用仪器Protein C-terminal Sequencer(LTQFinnigan)用tandem mass spectrometry的方法检测，见图6。
结果显示，rhSTAP经过RPC纯化后，纯度大于95％，分子量为21429，N-terminal 10个氨基酸序列为NH2-M-E-K-V-P-G-E-M-E-I，C-terminal 23个氨基酸序列为E-V-G-W-V-Q-Q-V-P-N-A-T-T-P-P-A-T-L-P-S-S-G-P，均与理论值吻合。
本发明公开了rhSTAP具有抗氧化的生物活性及活性检测方法，其步骤为将复性后的rhSTAP用总抗氧化能力检测试剂盒(南京建成生物工程研究所NJBI)检测。结果见图7，图7显示，rhSTAP具有明显的抗氧化活性，根据试剂盒的计算方法，抗氧化活性为80.0±3.0U/mg。
本发明研究了rhSTAP的生物活性及对氧化应激的肝星状细胞的保护作用，见实施例部分。试验结果表明rhSTAP通过缓解Fe-NTA对HSC造成的氧化损伤，抑制了HSC的氧化应激反应，从而抑制了HSC的活化。具体表现为改善了机体抗氧化损伤防御体系，脂质过氧化程度减轻，胶原蛋白的合成减少。表明rhSTAP具有防治肝硬化及肝纤维化的应用前景。
图1是hSTAP cDNA的PCR结果(ADNA marker；Lane BhSTAP cDNA)图2是rhSTAP在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达(A蛋白质分子量Marker；B菌体总蛋白；C菌体超声波破碎后，离心分离得到的可溶性蛋白；D经过Sephadex G-25层析柱复性、纯化后的rhSTAP)图3是rhSTAP利用质谱纯化后的结果图4是rhSTAP分子量的测定图5是rhSTAP N-terminal氨基酸序列的测定结果图6是rhSTAP C-terminal氨基酸序列的测定结果图7是rhSTAP抗氧化活性的检测具体实施方式
实施例1MDA是脂质过氧化的重要终产物之一，反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，可促进I型胶原mRNA的表达，与HSC增殖和胶原合成密切相关；SOD是机体抗氧化损伤防御体系中最重要的抗氧化酶之一，反映了机体清除氧自由基的能力。羟脯氨酸(Hyp)是构成胶原纤维特异的氨基酸成分，胶原纤维主要由胶原蛋白构成，而羟脯氨酸在胶原蛋白的含量较为稳定，约为2.5％，在非胶原蛋白中的含量很低，甚至缺乏，所以羟脯氨酸常被认为是胶原蛋白特有成份，肝组织细胞中Hyp的含量可较准确地反映肝组织胶原纤维含量，因此，测定肝组织细胞中羟脯氨酸含量可间接反映肝细胞纤维化的程度。
具体试验过程
1、取对数生长期的大鼠的肝星状细胞，2.5g/L胰酶消化后，用含100mL/L胎牛血清的DMEM配成细胞悬液；2、以105接种于10块6孔培养板，每孔加入DMEM培养液2ml，置于37℃，50mL/L CO2培养箱中培养过夜；3、24h后细胞贴壁良好，换用含2mL/L胎牛血清的DMEM培养，使其生长同步化。
4、再培养24h后，设立5个组别，第一组为阴性对照，另外4组加入次氮基三乙酸铁(Fe-NTA，终浓度200μmol/L)，并加入rhSTAP，终浓度分别为0μg/ml(模型组)、5μg/ml(低剂量组)、10μg/ml(中剂量组)、20μg/ml(高剂量组)；5、继续培养24小时后，采用丙二醛(MDA)试剂盒(NJBI)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(NJBI)、羟脯氨酸(Hyp)试剂盒(NJBI)分别检测细胞与培养液中的MDA、SOD、Hyp。实验结果见表2、3。
表2.rhSTAP对培养基中MDA、SOD、Hyp含量的影响
n＝12，x±s.ap＜0.01，bp＜0.05，与正常组相比；cp＜0.01，dp＜0.05，与模型组相比。
结果显示1、对比正常HSC组，模型组培养基中MDA、SOD、Hyp的含量有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力单位降低；2、对比模型组，rhSTAP低剂量组培养基中MDA、Hyp的含量变化不明显，SOD的活力单位有明显提高；3、对比模型组，rhSTAP中剂量组培养基中MDA、SOD、Hyp的含量有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力单位升高；4、对比模型组，rhSTAP高剂量组培养基中MDA、SOD、Hyp的含量有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力单位升高。
表3.rhSTAP对细胞内MDA、SOD、Hyp含量的影响
n＝12，x±s.ap＜0.01，bp＜0.05，与正常组相比；cp＜0.01，dp＜0.05，与模型组相比。
结果显示1、对比正常HSC组，模型组细胞内MDA、SOD、Hyp的含量有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力单位降低；2、对比模型组，rhSTAP低剂量组细胞内Hyp、SOD的含量变化不明显，MDA的含量有明显降低；3、对比模型组，rhSTAP中剂量组细胞内MDA、SOD、Hyp的含量有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力单位升高；4、对比模型组，rhSTAP高剂量组细胞内MDA、SOD、Hyp的含量有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力单位升高。
结果显示1、对比正常HSC组，模型组细胞内及培养基中MDA、SOD、Hyp的含量均有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力单位降低；2、对比模型组，rhSTAP低剂量组细胞内及培养基中MDA、SOD、Hyp的含量变化不够明显；3、对比模型组，rhSTAP中、高剂量组细胞内及培养基中MDA、SOD、Hyp的含量均有明显的差异，其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力单位升高。
结果说明了1、Fe-NTA对HSC造成了明显的氧化损伤，具体表现为其中MDA、Hyp的含量升高，SOD的活力单位降低。
2、Fe-NTA对HSC造成的氧化损伤，通过氧化应激的机制，引起了HSC的活化，促使HSC从静息态向活化态的转化，具体表现为破坏了机体抗氧化损伤防御体系，脂质过氧化程度加重，胶原蛋白的合成增加。
3、rhSTAP可以明显缓解Fe-NTA对HSC造成的氧化损伤，具体表现为其中MDA、Hyp的含量降低，SOD的活力单位升高。
4、rhSTAP通过缓解Fe-NTA对HSC造成的氧化损伤，抑制了HSC的氧化应激反应，从而抑制了HSC的活化。具体表现为改善了机体抗氧化损伤防御体系，脂质过氧化程度减轻，胶原蛋白的合成减少。
5、rhSTAP对HSC氧化损伤的保护作用有剂量依赖关系。浓度大于或等于10μg/mg，即有明显的作用。
权利要求
1.人源肝星状细胞激活相关蛋白或重组人源肝星状细胞激活相关蛋白用于制备治疗肝脏疾病药物的用途。
2.权利要求1的用途，其中肝脏疾病是肝硬化。
3.权利要求1的用途，其中肝脏疾病是肝纤维化。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人源肝星状细胞激活相关蛋白的医药用途，即其可以用于制备治疗肝脏疾病的药物的用途。本发明还公开了其重组制备方法。
文档编号C12N15/70GK101036781SQ20071002056
公开日2007年9月19日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者吴梧桐, 魏威 申请人:中国药科大学