针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小 干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇 管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成 增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步则发展成肝硬化。肝纤维化是可逆 的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的 最佳措施。
[0003] 肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型 转换是肝纤维化发生的中心环节。肝星状细胞的激活受众多细胞因子的调控，现有研究结 果证实Wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断Wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及 诱导其凋亡。但Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括细胞形态与功能的分化及维持、 免疫、细胞癌变与凋亡，直接阻断该信号通路可能具有广泛的不良生物学效应。R-脊椎蛋白 2(R-Spondin2)是新发现的Wnt信号通路的重要调控因子，R-Spondin2可以激活并增强Wnt/ β-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用。
[0004] RNA干扰(RNAi)是利用序列特异性的、与靶基因同源的双链RNA(dsRNA)对靶基因 转录后的信使RNA(mRNA)的分解，从而抑制靶基因表达的一种转录后基因沉默技术。其作用 机制是:dsRNA被Dicer酶识别，并被切割为小干扰RNA(siRNA) ^iRNA与RNA介导沉默复合体 (RISC)结合后，识别并降解同源的mRNA，特异性抑制目的基因的表达。由于RNA干扰抑制靶 基因表达具有特异性强、快速、高效等优点，尤其适合特异靶向性的基因治疗。
[0005] 最初RNA干扰采样体外合成siRNA的方法，但存在转染效率低、转移到细胞内的 siRNA不能持久性表达、对靶基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而限制了其应用。将siRNA 合成为短发卡RNA(shRNA)并由载体导入细胞，能在细胞内稳定的转录生成shRNA，并进一步 加工生成靶基因特异性的siRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是基于RNA干扰技术抑制R-Spondin2基因表达，使激活的肝星状细 胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] 根据GeneBank公布的人R-Spondin2蛋白基因的CDNA序列，应用SiRNA设计原则，设 计siRNA-R-Spondin2序列，经Blast比对，序列的特异性好。所述siRNA设计原则包括:革巴位 点在AA序列之后，GC碱基含量大于45%，长度在19-23个bp等。基于上述原则设计的一种针 对哺乳动物R_Spondin2基因靶点的小干扰RNA(siRNA-R-Spondin2)，所述小干扰RNA包含正 义链和反义链，其中：
[0009] 正义链序列为5'-GUUGGUCAUUGGAGCGAAU-3'，如SEQIDN0:l所示；
[0010]反义链序列为5'-AUUCGCUCCAAUGACCAAC-3'，如SEQIDN0:2所示。
[0011] 所述的哺乳动物为人。
[0012] 一种所述的小干扰RNA的用途，即所述的小干扰RNA通过化学合成法合成短发卡 RNA〇
[0013] 根据所述siRNA-R_Spondin2序列，应用shRNA设计原则，设计shRNA-R_Spondin2序 列。所述shRNA-R_Spondin2的两端带Hind III和BamH I酶切位点，中间loop接头序列为5'-TCAAGAG-3'，尾部带有RNA聚合酶III终止子TTTTTT。所述的shRNA设计原则包括:序列5'端 带限制性酶切位点，酶切位点下方紧连一个C，目的序列的第一个碱基为G，loop接头序列 应在shRNA序列中间，不能出现连续3个以上的T。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种由所述的小干扰RNA合成的短发卡RNA(shRNA-R-Spondin2)，包含正义链和反义链，其中：
[0015] 正义链序列为
[0016] 5'-GATCCCCGTTGGTCATTGGAGCGAATTCAAGAGATTCGCTCCAAT
[0017] GACCAACTTTTTTGGAAA-3'JnSEQIDN0:3K*;
[0018] 反义链序列为
[0019] 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGTCATTGGAGCGAATCTCTTGAATTCG
[0020] CTCCAATGACCAACGGG-3'JnSEQIDN0:4K*。
[0021]所述shRNA-R-Spondin2序列可由化学合成法合成。在肝纤维化的基因治疗中，本 发明的化学合成片段可能会经多种化学方法进行修饰以增加稳定性和靶向性。
[0022]本发明的另一目的在于提供一种含有所述的短发卡RNA的载体，其中所述的短发 卡RNA与病毒表达载体或非病毒表达载体相连。所述病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒 载体。所述非病毒表达载体为质粒载体。
[0023] 即所述shRNA序列可由多种载体导入细胞，包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载 体和逆转录病毒等。如将上述shRNA-R-Spondin2合成〇1 igo DAN单链片段并退火形成双链 DNA，其两端含酶切位点粘端，连入酶切后的载体质粒，构建的shRNA-R-Spondin2质粒载体。 或将shRNA-R-Spondin2与慢病毒载体质粒进行酶切并连接，并与骨架质粒、慢病毒包装质 粒共转染293T细胞，培养液离心形成浓缩病毒液，得到慢病毒载体Lenti-shRNA-R-Spondin2〇
[0024] 本发明还提供了所述的短发卡RNA的载体在制备肝纤维化基因治疗药物中的应 用。
[0025] 经实验证明，本发明设计的siRNA-R-Spondin2能有效抑制人肝星状细胞LX2中R- Spondin2基因的表达，降低了 Wnt信号通路的活性，促使肝纤维化的标志物α-SMA和 Collagen I的表达降低，抑制了人肝星状细胞LX2的增殖并使其恢复存储油脂功能。表明本 发明设计的针对R-Spondin2基因靶点的RNA干扰片段能促使激活的肝星状细胞回退到静止 状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
【附图说明】
[0026] 图1为pGCL-GFP载体结构体。
[0027] 图2为Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制R-Spondin2蛋白表达与mRNA水平。A.Western blot检测R_Spondin2蛋白表达；B.Real-time PCR 检测 R-Spondin2 的 mRNA 水平。
[0028]图3为免疫荧光检测Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2 后，抑制肝纤维化标志物α-SM和Collagen I的表达。
[0029]图4为Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制肝纤维 化标志物α-SMA和Collagen I蛋白及mRNA的表达。A.Western blot检测α-SMA和Collagen I 蛋白表达;B.Real-time PCR检测α-SMA和Collagen I的mRNA水平。
[0030] 图5为A.油红0染色检测Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝星状细胞 LX2后，LX2恢复油脂存储状态;B. MTT法检测Lent i-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体转染人肝 星状细胞LX2后，LX2增殖率下降。
【具体实施方式】
[0031] 以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，而 不用于限定本发明的范围。以下实施例中所涉及的技术，包括细胞培养、载体构建、细胞转 染、克隆、基因测序、Western blot检测、PCR扩增与检测、免疫荧光等分子生物学技术，除非 特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂、质粒、细 胞株等，除非特别注明，均为一般本领域的技术人员可以通过公共途径获得。
[0032] 实施例1 siRNA序列设计
[0033] 应用siRNA设计的原则（Petri S, siRNA design priciples and off-target effects .Methods Mol Biol · 2013; 986:59-71)筛选siRNA序列：（1)从转录本(mRNA)的AUG 起始密码开始，寻找"AA"二连序列，并记下其3'端的19-23个碱基序列作为siRNA的候选靶 位点；（2)siRNA序列的GC含量在45%至55%之间；（3)长度在19-23个bp; (4)不含反向重复 序列；（5)没有连续9个以上的GC序列；（6)正义链的5'端最好为G/C; (7)反义链的5'端最好 为A/U; (8)正义链的15-19碱基最好含有3个以上A/U; (9)反义链的5'端7个碱基中最好有5 个以上A/U。
[0034] 使用Blast(www.ncbi .nlm.nig. gov/Blast)将候选序列和基因组数据库进行同源 分析，保证设计的siRNA序列不会与人R-Spondin2基因之外的其他基因序列同源。得到的 siRNA 序列（siRNA-R_Spondin2)为：
[0035] 正义链序列为5' -GUUGGUCAUUGGAGC