一种来源于棉花的双向启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来源于棉花的双向启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 转基因作物上市19年后，伴随着单性状产品的逐渐丰富和研发单位的相互授权， 复合性状转基因产品已成为一个重要发展趋势。据ISAAA统计，复合性状转基因植物的种植 面积持续增加，2014年全球复合性状转基因植物种植面积达5140万公顷，比2013年增长 9 %，占转基因作物总面积的28 %，成为当前发展最快的转基因产品类型。在28个转基因作 物种植国家中，有13个国家种植了复合性状转基因植物，包括美国、巴西、阿根廷等13个国 家，其中美国复合性状转基因玉米和棉花的种植面积分别占玉米和棉花种植总面积的76 % 和 78 %。
[0003] 共转化和再转化是获得多基因复合转基因植物的常用方法。在培育过程中，驱动 目标基因表达的启动子的选择至关重要。已有研究表明，在两个启动子之间只要存在90bp 的同源性序列导入植物体内，就有可能引起基因表达的"共抑制"现象，进而导致部分基因 沉默。双向启动子的出现，为复合性状转基因植物的培育提供了很好的工具。
[0004] 双向启动子(bidirectional promoter)是指位于相邻且转录方向相反的两个基 因之间，能从正反两个方向同时启动基因表达的的一段DNA序列。目前已从水稻、玉米、拟南 芥、大豆、杨树等植物中克隆到了双向启动子，至今尚未见到有关棉花内源双向启动子方面 的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种来源于棉花的双向启动子及其应用。
[0006] 本发明提供了一种启动子，命名为GhZR，获自棉花，为如下⑴或(2)或⑶或(4):
[0007] (1)序列表中序列1所示的DNA分子(正向序列，命名为GhZRf);
[0008] (2)与序列表中序列1所示的DNA分子反向互补的DNA分子（反向序列，命名为 GhZRr)；
[0009] (3)在严格条件下与（1)或(2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0010] (4)与⑴或（2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分 子。
[0011]所述"与序列表中序列1所示的DNA分子反向互补的DNA分子"为序列表中序列4所 示的DNA分子。
[0012] 上述严格条件可为用〇 · 1 X SSPE(或0 · 1 X SSC)，0 · 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA杂 交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0013] 所述GhZR为双向启动子。
[0014] 含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保 护范围。
[0015] 所述表达盒可为表达盒I或表达盒II。
[0016] 所述表达盒1(单基因表达的表达盒)包括:一个所述启动子、一个目的基因和一个 终止子，由所述启动子启动所述目的基因的表达。所述终止子具体可为Nos终止子。所述目 的基因具体可为gfp基因或gus基因。
[0017] 所述表达盒II (双基因表达的表达盒）包括：两个目的基因（相同基因或不同基 因）、两个终止子(相同终止子或不同终止子)和一个所述启动子。由于所述启动子为双向启 动子，所述表达盒II中的两个基因转录方向相反，均由所述启动子启动表达。所述终止子具 体可为Nos终止子。所述两个目的基因具体可为gfp基因和gus基因。
[0018] 所述重组载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入所述启动子得到重组质粒。 所述植物表达载体具体可为载体pCambial305.1。所述重组载体具体可为将所述启动子插 入植物表达载体pCambial305.1的多克隆位点间得到的重组质粒。所述重组载体具体可为 将所述启动子取代植物表达载体pCambial305.1的Xbal和Ncol之间的小片段得到的重组质 粒。所述重组载体具体可为将所述启动子取代植物表达载体pCambial305.1的Xbal和Ncol 之间的小片段，同时将植物表达载体pCambial305.1的Ncol和BstEII酶切位点之间的片段 取代为序列表的序列2自5'末端第5至756位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒，所述 DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成gfp基因。所述重组载体具体可为将所述启 动子取代植物表达载体pCambial305.1的Xbal和Ncol之间的小片段，同时将gfp基因的反向 互补序列插入植物表达载体pCambial305.1的Xbal位点之间得到的重组质粒。
[0019] 所述gfp基因为序列表中序列2所示的DNA分子。所述"gfp基因的反向互补序列"为 序列表中序列3所示的DNA分子。
[0020] 扩增所述启动子的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0021] 本发明还保护所述启动子作为启动子的应用。所述作为启动子的应用具体可为作 为双向启动子的应用。
[0022] 本发明还保护一种特异DNA分子，包括基因甲、基因乙和位于所述基因甲和所述基 因乙之间的所述启动子;所述特异DNA分子中，所述基因甲和所述基因乙的转录方向相反， 均由所述启动子启动表达。
[0023] 所述特异DNA分子具体包括如下元件:终止子甲、所述基因甲、所述启动子、所述基 因乙、终止子乙。所述特异DNA分子中，形成两个转录方向相反的表达盒(共用所述启动子）， 一个表达盒(表达盒乙）包括所述启动子、所述基因乙和所述终止子乙，另一个表达盒(表达 盒甲）包括所述启动子、所述基因甲和所述终止子甲。
[0024]所述基因甲具体可为gfp基因或gus基因。所述基因乙具体可为gfp基因或gus基 因。
[0025]所述gfp基因为序列表中序列2所示的DNA分子。
[0026]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用所述启动子启动目 的基因的表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。
[0027]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中导入所述的特异DNA 分子，得到表达所述基因甲和所述基因乙的转基因植物。
[0028] 所述植物为双子叶植物。所述双子叶植物可为菊亚纲植物。所述菊亚纲植物可为 茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。所述夜香树族植 物可为烟草属植物。所述烟草属植物具体可为本氏烟。
[0029] 本发明所提供的来自陆地棉的双向启动子可从正反两个方向驱动报告基因 gfp和 gus在植物中同时表达，本发明有望为复合性状转基因植物的培育提供更佳的启动元件，在 农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
【附图说明】
[0030] 图1为植物表达载体pCambial305.1质粒图谱。
[0031 ]图2为各表达载体部分原件示意图。
[0032]图3为组织⑶S染色结果图。
[0033]图4为GFP表达分析结果图。
【具体实施方式】
[0034]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0035]陆地棉"苏棉12号"（简称苏棉12号）：参考文献:金仁龙，朱姝，张边江.不同培养条 件对苏棉12号茎尖组织培养的影响[J].广东农业科学，2011，38(3): 38-39公众可以从中 国农业科学院生物技术研究所获得。
[0036] 植物表达载体pCambial 305 . 1 :澳大利亚CAMBIA公司。植物表达载体 pCambial305.1的载体图谱见图1，部分元件示意图见图2A。
[0037] 植物表达载体pCamBIAl 302:澳大利亚CAMBIA公司。
[0038] pMD18-T载体:六合通经贸有限公司，产品目录号:D101A。
[0039] 根癌农杆菌LBA4404:BiovectorCo.，LTD，产品货号：Biovec-11。
[0040] 本氏烟：参考文献：Sainsbury F，Lomonossoff GP.Transient expressions of synthetic biology in plants.Curr Opin Plant Biol，2014,19:1-7·;公众可以从中国 农业科学院生物技术研究所获得。
[0041] 实施例1、启动子的发现
[0042] 1、对雷蒙德氏棉的基因组进行序列分析，发现其中两个基因的转录方向相反。 [0043] 2、根据步骤1中的两个基因的间隔区域设计引物GhZR-F和GhZR-R。
[0044] GhZR-F:5 '-TTTCGTCGGCGCTTGCGGCGG-3 '；
[0045] GhZR-R:5 '-TGGCAAACAAACAATGAGCTTGAG-3 '。
[0046] 3、以苏棉12号的基因组DNA为模板，采用GhZR-F和GhZR-R组成的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物。
[0047] PCR的反应条件为：94应预变性5min，94°C变性30s、58°C退火30s、72°C延伸2min， 30个循环;最后72°C充分延伸10min。
[0048] 4、将步骤3获得的PCR扩增产物和pMD-18T载体连接，然后进行测序。
[0049]通过上述步骤，发现一个双向启动子，将其命名为GhZRAhZR的一个方向命名为 GhZRf，另一个方向命名为GhZRr。GhZRf如序列表的序列1所示。
[0050] 实施例2、重组表达载体构建
[0051 ] 一、重组表达载体pCambial305· l_35S_gfp构建
[0052] 1、以pCamBIA1302质粒DNA为模板，采用gfp-Fl和gfp-Rl组成的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物。
[0053] gfp-Fl：5'-CACGGGGGACTCTTGACCATGGTAGATCTGACTAGT-3'；
[0054] gfp-Rl：5'-GGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCACACGTGGTGGTG-3'。
[0055] gfp-Fl和gfp-Rl中，下划线分别标注Ncol和BstEU酶切位点。
[0056] 2、用限制性内切酶Ncol和BstEII双酶切植物表达载体pCambial305.1，回收约 9790bp的载体骨架。
[0057] 3、将步骤1的PCR扩增产物和步骤2得到的载体骨架通过同源重组酶连接，得到重 组表达载体pCambial305. l-35S_gfp。根据测序结果，对重组表达载体pCambial305.1-35S-gfp进行结构描述如下:将植物表达载体pCambial305.1的Ncol和BstEII酶切位点之间的片 段取代为序列表的序列2自5'末端第5至756位核苷酸所示的DNA分子。重组表达载体 pCambial305. l-35S-gfp中插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的 序列2所示的gfp基因。重组表达载体pCambial305. l-35S-gfp的部分元件如图213所示。
[0058] 二、重组表达载体pCambial305.1-gfp-gus构建
[0059] 1、以pCamBIA1302质粒DNA为模板，采用gfp-F3和gfp-R3组成的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物。
[0060] gfp-F3:5，-GGTACCCGGGGATCCTCTAGATCACACGTGGTGGTGGTG-3，；
[0061 ] gfp-R3:5 '-TACCCTCAGATCTACCATGGATGGTAGATCTGACTAGTA-3'。
[0062] gfp_F3和gfp_R3中，下划线分别标注Xbal和Nco頂每切位点。
[0063] 2、用限制性内切酶Xbal和Ncol双酶切植物表达载体pCambial305.1，回收约 11060bp的载体骨架。
[0064] 3、将步骤1的PCR扩增产物和步骤2得到的载体骨架通过同源重组酶连接，得到重 组表达载体pCambial305 · Ι-gfp-gus。根据测序结果，对重组表达载体pCambial305 · 1-gfp-gus进行结构描述如下:将植物表达载体pCambial305.1的Xbal和Ncol酶切位点之间的片段 取代为序列表的序列3所示的DNA分子。重组表达载体pCambial305.1-gfp-gus的部分元件 如图2C所示。
[0065] 三、重组表达载体 pCambial305.1-GhZR