f-gus 构建
[0066] 1、以苏棉12号的基因组DNA为模板，采用GhZRf-Fl和GhZRf-Rl组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0067] GhZRf-F1:5 '-TACCCGGGGATCCTCTAGAAGGGTTTTGCAATTACAACA-3'；
[0068] GhZRf-Rl:5 '-TACCCTCAGATCTACCATGGTACTCGTTTACTTTTTGGCT-3'。
[0069] GhZRf-F和GhZRf-R中，下划线分别标注Xbal和Nco頂每切位点。
[0070] PCR扩增条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30s、58°C退火30s、72°C延伸2min， 30个循环;最后72°C充分延10min。
[0071] 2、用限制性内切酶Xbal和Ncol双酶切植物表达载体pCambial305.1，回收约 11060bp的载体骨架。
[0072] 3、将步骤1得到的PCR扩增产物和步骤2得到的载体骨架同源重组酶连接，得到重 组表达载体pCambial305 · 1-GhZRf-gus。根据测序结果，对重组表达载体pCambial305 · 1-GhZRf-gus进行结构描述如下:将植物表达载体pCambial305.1的Xbal和Ncol酶切位点之间 的小片段取代为了序列表的序列1所示的DNA分子。重组表达载体pCambial305.1-GhZRf-gus的部分元件见图2D。
[0073] 四、重组表达载体pCambial305.1-GhZRr-gfp构建
[0074] 1、以苏棉12号的基因组DNA为模板，采用GhZRr-Fl和GhZRr-Rl组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0075] GhZRr-F1:5 '-GTACCCGGGGATCCTCTAGATACTCGTTTACTTTTTGGCT-3'；
[0076] GhZRr-Rl:5 '-TACTAGTCAGATCTACCATGGAGGGTTTTGCAATTACAAC-3'。
[0077] GhZRr-Fl和GhZRr-Rl中，下划线分别标注Xbal和Nco頂每切位点。
[0078] PCR扩增条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min， 30个循环;最后72°C充分延lOmin。
[0079] 2、用限制性内切酶Xbal和Ncol双酶切重组表达载体pCambial305.1-35S_gfp，回 收约9767bp的载体骨架。
[0080] 3、将步骤1得到的PCR扩增产物和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组表达载体 pCambial305· Ι-GhZRr-gfp。根据测序结果，对重组表达载体pCambial305· Ι-GhZRr-gfp进 行结构描述如下：将重组表达载体pCambial305.1-35S-gfp的Xbal和Ncol酶切位点之间的 小片段取代为了序列表的序列4所示的DNA分子。重组表达载体pCambial 305.1-GhZRr-gfp 的部分元件见图2E。
[0081 ]四、重组表达载体pCambial305.1-gfp-GhZR-gus构建
[0082] 1、以pCamBIA1302质粒DNA为模板，采用gfp-F2和gfp-R2组成的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物。
[0083] gfp-F2:5 '-GGTACCCGGGGATCCTCTAGATCACACGTGGTGGTGGTG-3'；
[0084] gfp-R2:5，-TAATTGCAAAACCCTTCTAGAATGGTAGATCTGACTAGTA-3，。
[0085] gfp_F2和gfp_R2中，下划线分别标注Xba頂每切位点。
[0086] PCR扩增条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin， 30个循环;最后72°C充分延10min。
[0087] 2、用限制性内切酶Xba頂每切步骤三得到的重组表达载体pCambial 305.1 -GhZRf-gus，回收约12139bp的载体骨架。
[0088] 3、将步骤1得到的PCR扩增产物和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组表达载体 pCambial305.1-gfp-GhZR-gus。根据测序结果，对重组表达载体pCambial305 · 1-gfp-GhZR-gus进行结构描述如下:将重组表达载体pCambial305.1-GhZRf-gus的Xbal酶切位点间插入 了序列表的序列3所示的DNA分子。重组表达载体pCambial305.1-gfp-GhZR-gus的部分元件 见图2F。
[0089]实施例3、GhZR作为双向启动子的功能验证 [0090] 一、对gus基因的启动功能
[0091] 植物瞬时表达载体分别为:植物表达载体pCambial305.1、实施例2构建的重组表 达载体pCambial305 · Ι-GhZRf-gus、重组表达载体pCambial305.1-gfp-GhZR-gus、重组表达 载体 pCambial305.1-gfp-gus。
[0092]借助根癌农杆菌LBA4404将各个植物瞬时表达载体分别对烟草叶片进行瞬时转 染，具体如下：
[0093] 1、将植物瞬时表达载体导入根癌农杆菌LBA4404,得到重组农杆菌。
[0094] 2、挑选长到6-8个真叶时的本氏烟植株，选取距离顶部最近的嫩叶进行叶下表皮 注射(将〇D6QQnm = 0.1 -0.2的步骤2得到的重组农杆菌的菌悬液注射至叶片的三分之二或者 全部），然后在80%湿度下黑暗培养12-16h。
[0095] 3、完成步骤2后，50%湿度下光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)3天。
[0096] 4、完成步骤3后，取注射过重组农杆菌的叶片，进行GUS染色。
[0097] GUS染色方法具体为:将待染色叶片浸入X-gluc溶液中，用parafilm封口膜封口， 37 °C避光放置12小时，镜检前，用FAA固定液浸泡15min，之后依次用75 %乙醇溶液、85 %乙 醇溶液、95 %乙醇溶液和100 %乙醇脱色，除去色素，然后进行显微镜观察，白色背景下的蓝 色即为⑶S表达位点。
[0098] X-gluc溶液：10mM EDTA、0.1% (体积分数）TritonX-100、100mM磷酸钠缓冲液、 0.5mM，0.5mM亚铁氰化钾，0.1 % (体积分数)X-gluc，余量为水。
[0099] FAA固定液：由体积分数为38 %的甲醛溶液5ml、冰醋酸5ml和70 %酒精水溶液90ml 组成。
[0100] 组织GUS染色结果如图3所示。图3中，A为瞬时转染pCambial305.1-gus-gfp的叶 片，B为瞬时转染pCambial305 · l-35S-gus的叶片，C为瞬时转染pCambial305 · 1-GhZRf-gus 的叶片，D为瞬时转染pCambial305. 1-gfp-GhZR-gus的叶片。结果表明：瞬时转染 pCambial305. l-35S-gus的叶片中gus基因正常表达、叶片呈现蓝色，瞬时转染 pCambial305. Ι-GhZRf-gus的叶片中gus基因正常表达、叶片呈现蓝色，瞬时转染 pCambial305.1-gfp-GhZR-gus的叶片中gus基因正常表达、叶片呈现蓝色，而瞬时转染 pCambial305.1-gus-gfp的叶片中没有观察到gus基因表达。
[0101 ]上述步骤进行五次重复试验，结果一致。
[0102] 结果表明，GhZR正方向序列GhZRf具有启动子活性。
[0103]二、对gfp基因的启动功能
[0104] 植物瞬时表达载体分别为：实施例2构建的重组表达载体pCambiaHOS.l-gfp- gus、重组表达载体 pCambial305 · l-35S-gfp、重组表达载体 pCambial305 · Ι-GhZRr-gfp、重 组表达载体 pCambial305 · 1-gfp-GhZR-gus。
[0105] 步骤1至3同步骤一的1至3。
[0106] 4、完成步骤3后，取注射过重组农杆菌的叶片，进行GFP表达分析。
[0107]选取待测样本制作载玻片，在LSM700激光共聚焦显微镜下进行观察并拍照。
[0108] 结果如图4所示。图4中，A为瞬时转染pCambial305.1-gus-gif的叶片，B为瞬时转 染pCambial305 · l-35S-gfp的叶片，C为瞬时转染pCambial305 · Ι-GhZRr-gfp的叶片，D为瞬 时转染pCambial305 · Ι-gfp-GhZR-gus的叶片。结果表明：瞬时转染pCambial305 · l_35S-gfp 的叶片在叶表皮毛的头部和叶脉处观察到明显的绿色荧光信号，瞬时转染pCambial305.1-GhZRr-gfp的叶片在叶表皮毛的头部和叶脉处观察到明显的绿色荧光信号，瞬时转染 pCambial305.1-gfp-GhZR-gus的叶片在叶表皮毛的头部和叶脉处观察到明显的绿色荧光 信号，而瞬时转染pCambial305.1-gus-gif的叶片中没有观察到gfp基因的表达。
[0109]上述步骤进行五次重复试验，结果一致。
[0110]结果表明，GhZR反方向序列GhZRr具有启动子活性。
[0111 ] 综合步骤一和步骤二的结果，转染重组表达载体pCambial305.1-gus-GhZR-gfp的 叶片中能同时观察到gfp基因和gus基因的表达，说明GhZR具有双向启动子的活性，能同时 从正反两个方向驱动基因表达。
【主权项】
1. 一种DNA分子，为如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 序列表中序列1所示的DNA分子； (2) 与序列表中序列1所不的DNA分子反向互补的DNA分子； ⑶在严格条件下与⑴或⑵限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； (4)与⑴或(2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。2. 含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3. 如权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为在植物表达载体的多克 隆位点插入权利要求1所述DNA分子得到重组质粒。4. 扩增权利要求1所述DNA分子的全长或其任意片段的引物对。5. 权利要求1所述DNA分子作为启动子的应用。6. 权利要求1所述DNA分子作为双向启动子的应用。7. -种特异DNA分子，包括基因甲、基因乙和位于所述基因甲和所述基因乙之间的启动 子； 所述启动子为如下（1)或(2)或(3)或(4): (1) 序列表中序列1所示的DNA分子； (2) 与序列表中序列1所不的DNA分子反向互补的DNA分子； ⑶在严格条件下与⑴或⑵限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； (4)与⑴或(2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。 所述特异DNA分子中，所述基因甲和所述基因乙的转录方向相反，均由所述启动子启动 表达。8. -种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用权利要求1所述DNA分子启动目的基 因的表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。9. 一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中导入权利要求7中所述的特异DNA分 子，得到表达所述基因甲和所述基因乙的转基因植物。10. 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述植物为双子叶植物。
【专利摘要】本发明公开了一种来源于棉花的双向启动子及其应用。本发明提供的启动子，命名为GhZR，获自棉花，为如下(1)或(2)或(3)或(4)：(1)序列表中序列1所示的DNA分子(正向序列，命名为GhZRf)；(2)与序列表中序列1所示的DNA分子反向互补的DNA分子(反向序列，命名为GhZRr)；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；(4)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明提供的双向启动子可从正反两个方向驱动报告基因gfp和gus在植物中同时表达，有望为复合性状转基因植物的培育提供更佳的启动元件，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82, C12N15/113
【公开号】CN105624163
【申请号】CN201610208170
【发明人】王志兴, 王旭静, 杨江涛
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年4月6日