一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉一种种子和棉花纤维优势表达的启动子及 其应用。
【背景技术】
[0002] 棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上第一大天然纤维作物，作为重要的纺织 原料，棉纤维具有重要的经济价值。棉花又是最重要的油料作物，据统计，棉花是我国第三 大油料作物，世界第六大油料作物。近十年(2004~2013)全国的棉花产量稳定在600万吨到 750万吨之间（中国统计年鉴2014)，全国每年约有1500~1800万吨的棉籽产量，棉籽中含有 丰富的蛋白质和脂肪，是一个巨大的可利用资源。
[0003] 棉纤维是棉花所特有的一种种子表皮细胞，是从胚珠表皮细胞分化而来的单细 胞，这一特性就决定了棉花种子发育与纤维发育之间的不可分割的关系。棉花纤维是重要 的纺织工业原料，我国是棉纺织品消费和出口大国，因此，棉花生产在我国国民经济中占有 重要的地位。能否迅速提高我国棉花品种的纤维品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和 纺织品生产加工、纺织设备制造、外贸出口等行业的生存与发展。虽然利用传统的育种方法 曾在棉花品种改良上取得了很大的成功，但近20年来，世界棉花品种在产量上已经达到一 个平台期，利用现有的遗传资源和育种手段难以再大幅度提高棉花产量（Meredith W.R.Better Crops 2000 84(4):6~9)。单纯依靠常规育种改良棉花纤维品质相当困难。
[0004] 这是因为：1)棉花纤维强力、细度等品质性状基因与皮棉产量存在负连锁，常规育 种方法很难打破这种遗传上的负相关;2)我国的棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维 品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度）、异常棉(纤维强度与细度）以及四倍体的 海岛棉（纤维强度与细度)等，这些优良性利用基因工程的方法可以打破物种间的遗传障 碍，实现目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点。但是，外源基因 的导入可能会对植物生长和发育产生有害作用。在这种情况下，基因表达需要被限制在期 望的目标组织中。启动子是RNA聚合酶能够特异识别的一段DNA分子，也就是使转录开始的 部位。在基因表达的调控中，转录是基因表达调控的第一步，也是关键一步(Lewi，2005基因 VIII 669~705,北京:科学出版社）。启动子对外源基因在生物体中的表达时间、部位及水 平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。在棉花纤维品质的基因工程改良中，往往需 要外源基因特异或优势地在纤维细胞中表达，从而降低外源基因对棉花正常生长的影响。 如果采用棉花纤维优势启动子，则可以使目的基因的表达主要控制在纤维中。另外，棉纤维 是由种子表皮细胞伸长发育而来，种子的生长状态同样会对纤维的产量和品质形成产生影 响。因此，棉花纤维或种子优势启动子的克隆，对棉花纤维发育的基因功能研究和纤维品质 的基因工程改良，都具有十分重要的价值。
[0005] 前人通过利用纤维特异启动子，尝试通过生物工程技术改良棉花纤维的品质，已 有成功的报道。John等（John M E，Keller G.Metabolic Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 1996， 93:12768-12773)将乙酰CoA还原酶基因（phaB)和PHB合成酶基因（phaC)分别置于纤维特异 性启动子E6和FbL2A的控制下并转入陆地棉中，成功获得同时表达phaB和phaC基因的转基 因棉花。转基因棉花分析发现棉株纤维中不仅有phaB和phaC的特异表达，而且含有PHB颗 粒。HPLC分析结果表明：PHB的合成始于开花后10d，每克纤维干重含约30-3440yg的PHB并维 持到纤维成熟，而且PHB的存在的确提高了纤维的热绝缘性能。
[0006] 在基因工程改良棉纤维方面颇为人们关注的另一个焦点是美国Auburn大学 Daniell的研究工作。Daniell(Henry Daniell，Beltwide Cotton Conferences，1998,595 ~598)试图将编码含Val-Pro-Gly-Val-Gly重复单元的蛋白聚体（protein-based p 〇lymerS，PBPS)基因遗传转化棉花，使棉花细胞能特异表达出PBPs蛋白。PBPs蛋白广泛存 在于自然界中，如哺乳动物结缔组织中的弹性蛋白，分子内含有由多个氨基酸组成的重复 顺序，PBPs分子常表现出较强的弹性(弹性系数10.6~10.9Pa)。Danie 11 (Henry Danie 11， Beltwide Cotton Conferences，1998，595~598)认为将PHBs引进棉纤维，一方面有望提高 纤维的弹性和强度，另一方面纤维中蛋白质含量的提高，纤维吸水能力增强，与染料的亲和 力亦相应增强，这是目前常规育种方法所做不到的。
[0007] 特异启动子在棉花基因工程育种中的重要性，在Zhang等人的工作中表现的更为 突出（Zhang，et al，Nature Biotechnology，2011，29:453-458) eZhang等利用单克隆抗体 原位杂交技术对IAA进行细胞定位，发现IAA在开花当天的棉花纤维起始细胞中高浓度积 累；而无纤维突变体则没有明显的ΙΑΑ信号，表明ΙΑΑ对棉花纤维细胞的起始具有十分重要 的作用。棉花纤维细胞是由胚珠外珠被表层细胞经分化突起、伸长而形成的。研究表明，只 有开花后5天之内突起的表皮细胞(约占10%左右)可以发育成为具有纺纱价值的长纤维。 他们根据"生长素在棉花纤维突起细胞中极性分布"这一发现，分析了前人利用生长素改良 棉花纤维失败的原因。认为必须把生长素的极性分布与棉花纤维细胞发育的特点结合起 来，利用特异启动子对生长素合成酶基因进行特定部位、时间和强度上的精确调控，方能达 到改良纤维产量和品质的目的。于是他们将来自矮牵牛而且表达活性区在胚珠外表皮，控 制基因表达的时间在开花前2天到开花后8天的FBP7启动子，与生长素生物合成基因 iaaM融 合并导入棉花中。转基因棉花表型分析结果表明，不仅胚珠表面纤维数目增加、衣分得到提 高，而且纤维细度也得到改良，即转基因棉花纤维的产量和品质得到同步改良。先锋公司部 门副总裁Michael Lassner认为，该研究"清楚地证明了启动子的选择在性状改良上的重要 性"（《Faculty of 1000》，2011年9月14日）。"展现了新一代转基因作物的光明前景" (Jeffrey Chen，Nature Biotechnology，2011，29(5):407_409)〇
[0008] 棉花种子或纤维特异启动子在棉花基因工程改良中的巨大价值，使这类启动子得 到克隆。然而，目前能用于棉花基因改良的启动子仍然非常有限，因此，获得更多棉花种子 或纤维优势表达启动子，不仅对今后棉花纤维的基因工程改良和纤维发育基因功能研究， 而且对利用异源基因的生物反应器均具有重要的利用价值。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d，所述启动子具 有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010] 进一步地，本发明还提供了含有所述PSDP_d启动子的表达载体。其中所述表达载 体优选植物表达载体，更优选如图6所示结构的载体。
[0011] 进一步地，本发明还提供上述表达载体的转化体，其中所述转化体为根癌农杆菌。
[0012] 本发明的另一个目的是提供上述动子在制备转基因植物中的应用。
[0013] 本发明的另一个目的是提供上述表达载体在制备转基因植物中的应用，其中所述 转基因植物为转基因棉花和番茄。
[0014] 本发明的又一个目的是提供一种利用动子制备转基因植物的方法，包括 下述步骤：
[0015] ⑴构建具有如SEQ ID No.l所示序列的启动子；
[0016] (2)将所述启动子可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；
[0017] (3)将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；
[0018] (4)将所述转