C退火30s、72°C延伸lmin，共35个 循环，最后72°C延伸lOmin。
[0068] 扩增产物在含溴乙锭的1%琼脂糖凝胶上以5V/cm的电压电泳后，紫外灯下观察照 像。
[0069] 转基因番茄的PCR验证结果见图7,结果表明1(2、1(8、1(18、1(9和1(14为转基因阳性植 株，其余株系为转基因阴性植株。
[0070] 转基因棉花的PCR验证结果见图9,结果表明转基因株系均为阳性株系。
[0071] 实施例6GUS的组织化学染色及观察
[0072]取新鲜的转基因番茄、陆地棉材料，切成小块后置1.5mL离心管中，加入⑶S染色液 (10mmol/LEDTA，100mmol/L磷酸钠缓冲液ρΗ7·0,0· lmol/L K3[Fe(CN)6]，0.1mol/L K4[Fe (CN)6]，0.1%(V/V)Triton X-100,5mg/ml X-Glue)。将含有植物材料和GUS染液的离心管， 放入37.0°C恒温温箱中，染色3h。最后倾去染色液，通过70%乙醇脱色后，观察照相。
[0073] 转pBI101-PSDP_dS因番茄中的⑶S染色结果见图8,结果显示⑶S基因在转基因番 茄种子以及种皮毛中优势表达在茎、叶中不表达。即该启动子具有番茄种子优势表达特异 性。
[0074] 转pBI101_PSDP_dS因陆地棉的⑶S染色结果见图10,结果发现在果柄、幼茎的表 皮毛、开花前一天的花瓣、萼片以及在开花当天的胚珠、纤维发育四个不同时期的胚珠和纤 维中均观察到⑶S染色的蓝色信号，表明⑶S基因在这些组织中有表达。但是在叶片中未发 现有GUS基因的表达。从开花当天的棉花胚珠表面开始出现GUS的蓝色信号，特别在纤维发 育的快速伸长期，次生壁合成期纤维特异细胞中有强烈的GUS阳性信号存在，表明该启动子 在陆地棉中具有纤维中、后期优势表达特性，在纤维细胞的基因工程改良中，可以用于驱动 目的基因在纤维细胞发育的中后期表达，具有重要的应用价值。
[0075] 实施例7转基因棉花中⑶S的酶活检测
[0076] GUS基因编码β-葡萄糖苷酶，该酶是一种水解酶。以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛 酸苷(4-MUG)为底物，⑶S催化其水解为4-甲基伞形酮(4-MU)及β-D葡萄糖醛酸。4-MU分子中 的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。
[0077] a、GUS粗酶液的提取
[0078] 选择已开花的转基因棉花，于开花当天挂牌标记开花时间。取开花后0d、5d、15d、 25d、40d的胚珠以及开花后5(1、15(1、25(1、40(1的纤维样品。常规方法对萼片、花瓣、花蕊和果 柄取样。将待测的植物样品置液氮中研磨成粉，加入2倍体积的GUS酶提取缓冲液制成匀浆， 冰上放置lh。于13000rpm/min离心10min，收集上清夜，Bradford法测定⑶S粗酶液中总蛋白 的含量。
[0079] b、4_MU标准曲线的制作
[0080] 首先，用少量的N，N-二甲基甲酰胺溶解4-MU固体，然后用双蒸水稀释成lmmol/L的 母液。其次，用反应终止液将4-MU母液稀释成100ymol/L、80ymol/L、60ymol/L、40ymol/U^ 20ymol/L的高浓度梯度样品，以及10ymol/L、8ymol/L、6ymol/L、4ymol/L和2ymol/L的低浓 度梯度样品。在激发光360nm，发射光460nm的条件下测定各样品的荧光强度，以反应终止液 为空白对照，每种浓度样品各设置3个重复，通过计算平均值绘制标准曲线。
[0081 ] C、GUS酶活的荧光测定
[0082] 于37°C水浴中预热反应缓冲液，同时在6个96微孔酶联板中，以180μ1/孔加入反应 终止液。在样品离心管中加入195μ1预热的反应缓冲液和5ylGUS粗酶液，混匀，立即取出20μ 1加入到1号板中，此为反应0时的样品（荧光测定时以此为空白），并严格记时。将反应板放 入37°C水浴中进行酶反应20min时各取20μ1反应液加入到2号板中。
[0083]样品焚光测定以1号板为空白，在酶标仪上以激发光360nm，发射光460nm的条件下 测定2号板各样品的荧光强度。根据得到的荧光强度值选择相应的标准曲线，由回归方程计 算出2号板中4-MU含量。酶活力单位定义为:每分钟水解4-MUG生成lnmol 4-MU的酶量为一 个单位。GUS基因的表达活性以每毫克总蛋白的酶活力表示，即4-MU nmol/mg/min。
[0084]对转基因棉花不同组织GUS酶活性的检测结果可知：花瓣、萼片、花蕊和果柄中， GUS酶活性较低在1.2~7.3nmol/mg/min之间。开花当天到开花后40d胚珠的⑶S酶活同样很 低在1.78~2.13nmol/mg/min之间。但是开花后5d到开花后40d纤维的GUS酶活非常高在 73.00~412.1]11]1〇1/11^/1]1；[11之间，最高点在15(1到25(1之间，再次证明该启动子主要在纤维发 育的中后期优势表达。
[0085]上述实施例表明，本发明克隆的PSDP_d启动子核苷酸长度为2822bp，当该启动子 与报告基因融合后，在番茄中能指导报告基因在种子及种皮毛中表达;在陆地棉中能指导 报告基因在纤维细胞发育中后期优势表达。以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本 领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求所定义的范围。
【主权项】
1. 一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d，其特征在于，所述PSDP_d启动子的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2. -种含有权利要求1所述PSDP_d启动子的表达载体。3. 如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体。4. 如权利要求2所述的载体，其特征在于:所述的表达载体具有如图6所示结构。5. -种含权利要求1所述的启动子的转化体。6. 权利要求1所述的动子在制备转基因植物中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为棉花或番茄。8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于将所述PSDP_d启动子下游连接目的基因，构建 植物表达载体，转化宿主植物。9. 一种利用有权利要求1所述PSDP_c^动子制备转基因植物的方法，包括下述步骤： (1) 构建具有如SEQ ID No. 1所示序列的启动子； (2) 将所述启动子可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体； (3) 将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体； (4) 将所述转化体转化植物，获得转基因植物。10. -种利用权利要求1所述?30?_(1启动子制备转基因棉花的方法，包括下述步骤： (1) 构建具有如SEQ ID No. 1所示序列的启动子； (2) 将所述启动子可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体； (3) 将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体； (4) 将所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体涉一种种子和棉花纤维优势表达的启动子及其应用。本发明涉及的问题是为棉花品种的改良提供一种新的选择。本发明的技术方案是一种种子和棉花纤维优势表达启动子PSDP_d，其具有如SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列，本发明还包括具有SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主。本发明还涉及该启动子的应用，本发明的启动子可以用于植物种子或棉花纤维的遗传改良。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00, C12N15/113, C12N1/21
【公开号】CN105624161
【申请号】CN201610137582
【发明人】侯磊, 林显凤, 杨洋, 李志磊, 余艳, 裴炎, 梁爱敏, 李先碧, 肖月华, 罗明, 金丹, 赵娟
【申请人】西南大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月11日