化体转化植物，获得转基因植物。
[0019] 本发明的又一个目的是提供一种利用动子制备转基因棉花的方法，包括 下述步骤：
[0020] (1)构建具有如SEQ ID No.l所示序列的启动子；
[0021] (2)将所述启动子可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；
[0022] (3)将步骤(2)获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；
[0023] (4)将所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。
[0024]本发明的种子和棉花纤维优势启动子序列，其至少含有SEQ ID NO.1所示的核苷 酸序列，该序列为根据棉花GhSDP基因序列设计引物，采用PCR方法，得到的长度为2822bp的 PSDP_d启动子序列。序列中含有多种植物激素如赤霉素响应元件GARE(TCTGTTG 577-583)、 生长素响应元件TGA-box(TGACGTAA 1768-1775)，脱落酸响应元件ABRE(CACGTG 645-650) 茉莉酸响应元件TGACG-motif(TGACG 1768-1772)和胚乳特异相关的GCN4(TGTGTCA 1441-1447)特异表达元件，逆境胁迫反应如低温LTR(CCGAAA 587-593)、伤害WUN(TCATTACGAA 1777-1786)、压力TC-富集重复区（GTTTTCTTAC 813-822 587-596)等相关元件。该序列中还 包含多个厌氧诱导元件ARE(TGGTTT 2226-2231、2299-2304、2397-2404、2482-2487)，与]\^8 转录因子结合位点有关的MBS(TAACTG 108-114)，细胞周期和昼夜节律相关的circadian (CAANNNNATC 626-632 752-758)，多个GATA-box、CATA-box、AAGAA-motif等大量顺式调控 元件及与TFII结合的核心序列TATAA。通过在转基因番茄和转基因棉花中⑶S组织化学染色 检测，证实该启动子驱动GUS基因在转基因番茄种子以及陆地棉纤维细胞中优势表达。
[0025] 本发明中，采用基因工程方法，将PSDP_d启动子插入到适宜的表达载体中即可获 得含有该启动子的植物表达载体。
[0026] 本发明将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。具体的， 采用电击法将含有PSDP_d启动子的植物表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中获得转化 体。
[0027] 将本发明的动子与报告基因构建植物表达载体，将所述植物表达载体转 化宿主获得含PSDP_d启动子的转化体，以及用所述转化体转化植物获得转基因植物。所述 转基因植物优选为番茄或陆地棉。
[0028]本发明的有益效果:获得了棉花纤维和种子优势表达的启动子P SDP_d，该启动子 在番茄中具有种子特异表达活性，在陆地棉中具有纤维和种子优势表达特性，为基因工程 改良番茄、棉花种子和纤维以及种子作为生物反应器提供了新选择和有效的途径。
【附图说明】
[0029] 图1表示GhSDP基因在陆地棉不同组织中的表达量(Relative Expression);
[0030] 以陆地棉根、幼茎、叶、子叶、下胚轴、花萼、花瓣、开花当天胚珠、开花后9d的胚珠 和开花后9d的纤维中的cDNA为模板，经实时定量PCR扩增的结果；该基因在开花当天胚珠、 开花后9d胚珠及纤维和叶中的表达量很低，在下胚轴、子叶、幼茎、花瓣及根中表达量较高 较低，而在花萼中的表达最高。
[0031] 图2表示GhSDP基因在陆地棉纤维不同发育时期的表达量（Relative Expression)；
[0032] 以开花当天胚珠、开花后5(1、9(1、13(1、15(1、17(1、19(1和21(1的纤维中的〇0财为模板， 经实时定量PCR扩增，该基因在纤维整个发育过程中，中后期的表达高于前期，其中开花后 15d达到最高，然后持续高表达。该基因的表达属于纤维中、后期优势表达基因。
[0033]图3表示PSDP_d启动子的核苷酸序列图；
[0034]该序列中含有多个顺式调控元件。
[0035] 图4表示PSDP_d启动子克隆到pEASY-B 1 un t载体上的质粒图谱；
[0036] 其中载体主要元件标示，pUC origin质粒复制起点；Ampicillin resistance 0RF:氨节青霉素抗性基因 ；Kanamycin resistance 0RF:卡那霉素抗性基因；其余为限制性 内切酶位点。
[0037] 图5陆地棉PSDP_d启动子表达载体的构建流程图；
[0038] 图6动子表达载体pBI101-PSDP_d的结构图；
[0039]图5和图6中载体主要元件标示，rep origin质粒复制起点;NPTII:新霉素磷酸转 移酶基因；GUS:0-葡萄糖酸苷酶基因 ；NOS terminator :N0S基因终止子;NOS Promo ter: N0S 组成性启动子;LB、RB: T-DNA插入左、右边界。
[0040] 图7表示转PSDP_d :: GUS融合基因番茄的PCR验证结果；
[0041 ] DL2K为标准分子量DNA(Mark2000)，K-2~K-21为不同的转基因株系，CK-为非转基 因对照。结果显示1(2、1(8、1(18、1(9和1(14为转基因阳性植株，其余株系为转基因阴性植株。
[0042] 图8表示转PSDP_d :: GUS融合基因番茄中的⑶S染色结果；
[0043] GUS基因在转基因番茄种子以及种皮毛中优势表达在茎、叶中不表达。其中，A:萌 发后5天的幼苗;B:真叶；C:横切幼茎;D:横切花蕾;G: D中胚珠部分的放大;E:横切幼果期 (IMG)的番茄果实;H:E中种子部分的放大图;F:横切绿熟期(MG)的番茄果实；I:F中种子部 分的放大图；J:横切破色期(Br)的番茄果实;K: J中种子部分的放大图；L:横切成熟期(Ri) 的番茄果实。
[0044] 图9表示转PSDP_d :: GUS融合基因棉花的PCR验证结果；
[0045] DL2K为标准分子量DNA(Mark2000)，Cl~C13为不同的转基因株系，CK-为非转基因 对照。结果显示Cl、C2、C5和Cl 1为转基因阳性植株，其余株系为转基因阴性植株。
[0046] 图10表示转PSDP_d :: GUS融合基因陆地棉的⑶S染色结果；
[0047] GUS基因在果柄、幼茎的表皮毛、开花前一天的花瓣、萼片以及在开花当天的胚珠、 纤维发育四个不同时期的胚珠和纤维中均观察到GUS染色的蓝色信号，表明GUS基因在这些 组织中有表达。但是在叶片中未发现有GUS基因的表达。从开花当天的棉花胚珠表面开始出 现GUS的蓝色信号，特别在纤维发育的快速伸长期，次生壁合成期纤维特异细胞中有强烈的 GUS阳性信号存在，表明该启动子在陆地棉中具有纤维中、后期优势表达特性。其中A:叶片； B:茎的横切;C:茎的放大;D:萼片;E:花瓣;F:果柄;G:开花当天棉铃的纵切;H:开花当天的 胚珠;I:开花后5d棉铃横切;J:开花后10d的胚珠纤维;K:开花后15d棉铃横切;L:开花后25d 棉铃横切;Μ:开花后40d棉铃横切;N:开花后45d棉铃横切。
[0048] 图11表示转PSDP_d :: GUS融合基因陆地棉的GUS酶活检测结果；
[0049] 检测转PSDP_d :: GUS融合基因陆地棉不同组织的⑶S酶活性，结果可见转基因棉花 花瓣、萼片、花蕊和果柄中，GUS酶活性较低在1.2~7.3nmol/mg/min之间。检测开花当天到 开花后40d的胚珠，GUS酶活同样很低在1.78~2.13nmol/mg/min之间。检测开花后5d到开花 后40d的纤维，其⑶S酶活非常高在73.00~412. lnmol/mg/min之间，可见该启动子主要在纤 维发育的中后期优势表达。
【具体实施方式】
[0050] 以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对