本发明进行限 定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求 所定义的范围。
[0051] 本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明 的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell ,2001)。
[0052] 实施例1陆地棉各个组织RNA的提取及定量PCR分析
[0053] 利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取棉花各个组织的RNA。参照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)说明书进行cDNA-链的逆转录，用作 定量RT-PCR分析模板。采用iQ SYBR Green Supermix(BIO-RAD)试剂分析目的基因的相对 表达量。内标基因选择陆地棉的Ghhis3基因(AF024716)，引物为Ghhisl和Ghhis2分别如SEQ ID N0.8和SEQ ID如.9所示；61150?基因定量？0?引物为61150?-1?1'卯和61150?-1^(111分别如 SEQ ID N0.2和SEQ ID如.3所示。扩增条件为：95°(：预变性3111丨11;95°(：变性2〇8,56°(：退火 20s，72 °C延伸30s，40个循环。
[0054]利用Bio-Rad CFX 3.0软件，通过计算各材料中目的基因和内标的比值，可得目的 基因在不同器官组织中的相对表达量。结果如图1所示，该基因在野生型陆地棉的叶片、胚 珠(开花后〇d和9d)、纤维(开花后9d)中表达较低，在花萼和下胚轴中的表达较高;进一步比 较该基因在纤维发育的不同阶段的表达发现:在开花后15d以后的纤维中表达较高，表明该 基因属于纤维发育中后期优势表达基因。
[0055] 实施例2陆地棉PSDP_d启动子的克隆
[0056]采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提 取陆地棉冀棉14(该陆地棉品种由河北农业大学马峙英教授惠赠）的基因组DNA，用设计合 成的该启动子的特异引物PSDP_d-up和PSDP_d-dn(SEQIDN0.4和5)，以上述的DNA为模板， 扩增该启动子序列。扩增体系如下：10 XPCR buffer for K0D Plus 5yL，25mmolMgS〇4 5μ L，2mmo 1 /L dNTPs 2yL，引物PSDP_d-up (5μπιο 1 /L) 2yL，引物PSDP_d-dn (5μπιο 1 /L) 2yL，K0D Plus聚合酶lU/yL，陆地棉DNA约60ng，双蒸水补足至50yL。扩增程序为：94°C，2min; 94°C， 15sec，53°C，30sec，68°C，2min，35个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带，按 照说明书的方法克隆至pEASY_Blunt平端载体上，阳性克隆寄至上海英俊公司测序验证，得 到pEASY-PSDP_d载体（见图4)及PSDP_d启动子序列如SEQ ID NO. 1所示。利用分析软件 (Plant CARE，http: //intra .psb .ugent · be: 8080/PlantCARE/)，从植物启动子数据库中对 该序列进行启动子调控元件分析，发现该序列中含有多种植物激素如赤霉素响应元件GARE (TCTGTTG 577-583)、生长素响应元件TGA-box(TGACGTAA 1768-1775)，脱落酸响应元件 ABRE(CACGTG 645-650)茉莉酸响应元件TGACG-motif (TGACG 1768-1772)和胚乳特异相关 的GCN4(TGTGTCA 1441-1447)特异表达元件，逆境胁迫反应如低温LTR(CCGAAA 587-593)、 伤害WUN(TCATTACGAA 1777-1786)、压力TC-富集重复区（GTTTTCTTAC 813-822 587-596)等 相关元件。该序列中还包含多个厌氧诱导元件ARE(TGGTTT 2226-2231、2299-2304、2397-2404、2482-2487)，与1^转录因子结合位点有关的冊3(了44(^108-114)，细胞周期和昼夜 节律相关的circadian(CAANNNNATC 626-632 752-758)，多个GATA-box、CATA-box、AAGAA-motif等大量顺式调控元件及与TFII结合的核心序列TATAA(图3)。
[0057]实施例3DNA片段回收、表达载体构建并大肠杆菌转化
[0058] DNA的琼脂糖电泳结束后，在紫外灯下用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝 胶块，按照试剂盒(Roche公司）的方法回收相应的DNA片段，构建到pBI 101上。载体构建的具 体流程见图5,首先从该启动子的克隆载体pEASY-PSDP_d中利用限制性内切酶Spel和EcoRV 将启动子片段切出，然后克隆到表达载体PBI101的Xbal和Smal位点中并置于GUS报告基因 上游，从而构建pBI 10l-PSDP_c^^正向表达载体（图6)。所有限制性内切酶均购自Roche公 司，按照使用说明书操作。
[0059]回收的片段与载体片段的连接体系为：10XT4DNA连接缓冲液lyL，载体DNA片段1μ L，外源连接产物DNA片段lyL，T4DNA连接酶lyL，用双蒸水补足体积至10yL。其中，载体DNA片 段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3,16°C连接12h。之后将连接产物转化至大肠杆菌 DH5a 中。
[0060]实施例4农杆菌及番茄和棉花的遗传转化
[00611用电击法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。
[0062] 按照OMEGA公司质粒提取试剂盒(D6943-01)说明书的步骤，提取pB 1101 -?30?_(1植 物表达载体质粒，参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，通过电激转化法将该质粒转入农 杆菌LBA4404中。
[0063]番前的遗传转化：利用农杆菌介导的子叶转化法（J · S · C · Van Roeke 1，B · Damm， L.S.Melchers,A.Hoekema Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum)Plant Cell Rep. ,12(1993),pp.644-647)，对番前进行遗传 转化，番茄材料为购自当地农贸市场的品种红丹。将获得的转基因番茄植株通过PCR扩增的 方法进行筛选，采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方 法提取转基因番茄的DNA，然后将PCR呈阳性的植株种植于温室中，常规管理。
[0064]陆地棉的遗传转化：采用农杆菌介导的方法对陆地棉冀棉14进行遗传转化（Luo et al.，2007)，将获得的转基因棉花植株通过PCR扩增的方法进行筛选，采用艾德莱生物公 司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提取转基因棉花的DNA，然后进 行PCR扩增鉴定，将阳性的幼苗置于清水中，22°C培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。 [0065] 实施例5转基因植株的PCR验证
[0066] 采用艾德莱生物公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒，按照说明书的方法提 取转基因番茄和棉花的D N A。根据G U S报告基因的序列设计特异引物G U S - 1 : AGCGTAATGCTCTACACCACG(SEQ ID N0.6)和⑶S-2:GTAATGCG AGGTACGGTAGG(SEQ ID N0.7) 用于特异PCR扩增。转基因植株DNA进行PCR体外扩增验证的条件：反应总体积为25yL，包括 10XLA Taq buffer 2.5yL、每种dNTP 100ymol/L、1.5mmol/L MgCl2、模板DNA 10ng、上下 游引物各400nmol/L、l单位LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司）。
[0067] 扩增条件:94°C变性4min，继以94°C变性30s、55°