GAAU-3'
[0036] 反义链序列为5'41]1^!；〇]〇^六1?六0^六(：-3'。
[0037]所述siRNA序列长度均为19bp，易于合成。
[0038]实施例2 shRNA设计及合成
[0039]应用shRNA设计原则（Sun G,Molecular Properties,Functional Mechanisms, and Applications of Sliced siRNA.Mol Ther Nucleic Acids.2015Jan 20；4:e221.), 根据上述siRNA-R-Spondin2序列，设计shRNA序列：（1)两条互补的寡核苷酸两端须带有限 制性酶切位点；（2)酶切位点下方紧连一个C，以确保转录发生；（3)shRNA目的序列以G碱基 开始，以确保RNA聚合酶转录；（3)shRNA插入的loop接头序列应当靠近寡核苷酸的中间，5'- TCAAGAG-3'最有效；（4)shRNA只能有一个特定且唯一loop构造；（5)shRNA片段尾部插入5-6 个T，以确保RNA聚合酶III终止转录；（6)G/C含量为40%至50% ; (7)shRNA序列应避免连续 三个以上的G/C/A/T出现。得到的shRNA序列（shRNA-R-Spondin2)为:正义链序列为
[0040] 5'-GATCCCCGTTGGTCATTGGAGCGAATTCAAGAGATTCGCTCCAAT
[0041 ] GACCAACTTTTTTGGAAA-3'
[0042]反义链序列为
[0043] 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGTCATTGGAGCGAATCTCTTGAATTCG
[0044] CTCCAATGACCAACGGG-3'
[0045] 所述shRNA序列两端带有BamH I和Hind III限制性酶切位点。应用化学合成法合 成包含上述shRNA序列的DNA模板序列及互补序列。
[0046]实施例3质粒载体构建
[0047] 将上述shRNA-R-Spondin2合成oligo DAN单链片段并退火形成双链DNA，连接 pGCL-GFP载体(上海吉凯），构建质粒载体pGCL-GFP-shRNA-R-Spondin2(参见图1)。该质粒 载体将在细胞内转录出shRNA，并经细胞内修饰后产生针对R-Spondin2基因靶点的siRNA-R-Spondin2。退火及连接过程如下：
[0048] 1.退火成双链DNA
[0049] 1)在0.5ml无菌离心管中建立以下退火反应体系(室温）： DNA模板正义链 5μ1 DNA模板反义链 5 μ1
[0050] 5 X DNA 退火 Buffer 20 μι Dnasc/Rnasc-Frcc H?0 20 μL
[0051 ] 2)95°C温育4分钟，70°C温育10分钟；
[0052] 3)取出离心管，室温放置5-10分钟，冷却至室温；
[0053] 4)短暂离心，混匀。
[0054] 2.双链DNA连接至pGCL-GFP载体
[0055] 本发明合成的DNA模板序列退火后，前后端分别形成BamH I和Hind III内切酶的 粘性末端，与经BamH I和Hind ΙΠ 酶切的线性化pGCL-GFP载体连接。
[0056] 1)将50μΜ退火双链DNA用Dnase/Rnase-Free H20稀释至500nM:
[0057] 50μΜ 双链 DNA ΙμL
[0058] Dnase/Rnase-Free Η2Ο 99μ1
[0059] 2)pGCL-GFP质粒用BamH I和Hind III双酶切，酶切体系为： pGCL-GFP 3 μL 10 X Buffer 2μΙ
[0060] BamH I 0.5 μL Hind 111 0 5 μL Dnasc/Rnasc-Frcc H20 14 μ!
[0061] 3)室温下建立如下连接反应体系： 5X 迮接 BuiTcr 4 μL pGCL-GFP线性化载体 2 μL
[0062] 双链 DNA 1 μL Dnasc/Rnasc-Frcc H2O 12 μL T4 DNA 迮接岣(丨 U/μΙ) I μΙ
[0063] 4)充分混匀后，室温孵育1小时。
[0064] 3.质粒载体转化感受态细菌
[0065] 1 )DH5a感受态细菌4°C冰浴5分钟；
[0066] 2)加入新构建的质粒载体10μ1，4°C冰浴30分钟；
[0067] 3)加入LB细菌培养液(NaCl lg，蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，溶于100ml H20,高压 湿热灭菌)30μ1，混匀，37 °C水平震荡(200rpm) 1小时；
[0068] 4)加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养板上，37 °C孵育过夜；
[0069] 5)挑选5-10个克隆菌落，与含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基中摇菌。
[0070] 4.质粒提取及鉴定
[0071] 1)取过夜震荡培养的菌液(3ml)，放入离心管中，室温下离心（3000rpm)5分钟，收 集菌体，重悬于250μ1的细胞悬浮液中；
[0072] 2)加入250μ1碱裂解液，混匀，室温静置5分钟；
[0073] 3)加入350μ1中和液，混匀，室温下离心（lOOOOrpm) 10分钟；
[0074] 4)将上清液移入吸附柱，室温下离心（lOOOOrmp) 1分钟。倒掉收集管中的液体，将 吸附柱放入同一收集管中；
[0075] 5)吸附柱中加入750μ1洗涤液(含60%无水乙醇），室温下离心（lOOOOrpm) 1分钟。 倒掉收集管中的液体，重复洗涤一次。倒掉收集管制液体，将吸附柱放入同一收集管中，室 温下离心（l〇〇〇〇rpm) 1分钟，除去残余乙醇；
[0076] 6)将吸附柱放入1 .5ml离心管中，中吸附膜中央加入50μ1洗脱液（Tris- HCL2.5mM)，50°C温育1分钟，收集质粒DNA;
[0077] 7)对克隆质粒分别用限制性内切酶BamH I和Hind III做双酶切鉴定；
[0078] 8)对双酶切初步鉴定阳性的克隆质粒进行PCR鉴定，引物序列为：
[0079] 上游引物：5' -GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3'
[0080] 下游引物：5' -GTAATACGGTTATGCACGCG-3'
[0081 ] 扩增条件:94 °C 10分钟，1个循环;94°C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，30个循环；72 °C 6 分钟，1个循环。
[0082] 9)对PCR鉴定阳性的克隆质粒进行DNA测序鉴定。
[0083]实施例3慢病毒载体构建 [0084] 1.慢病毒包装
[0085] 1)用0.25 %胰酶消化生长状态良好的293T细胞，并于感染前一天接种到10cm培养 皿；
[0086] 2)制备慢病毒包装系统三种质粒DNA溶液：
[0087] pGCL-GFP-shRNA-R-Spondin2 载体 20yg
[0088] pHelper 1.0载体 15yg
[0089] pHelper 2.0载体 10yg
[0090] 与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟；
[0091] 3)取100μΙ Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温 下温育5分钟。把稀释后的DNA与稀释后的Lip〇fectamine2000进行混合，轻轻颠倒混匀5分 钟。室温下温育20分钟；
[0092] 4)将0嫩与1^?(^6(^31^1^2000混合液转移至细胞密度达70%-80%的2931'细胞 培养液中，混匀，培养8小时后更换培养基，继续培养48小时；
[0093] 5)收集转染48小时后的293T细胞上清液。4°C，离心（lOOOrpm)lO分钟，0.45μπι滤器 过滤，4°C，离心（lOOOrpm) 15分钟，收集慢病毒浓缩液，得到Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病 毒载体。分装，_80°C保存。
[0094] 2.病毒滴度测定
[0095] 1)按相同浓度接种生长状态良好的293T细胞到96孔板，分为两组，每组5个孔；
[0096] 2)使用病毒感染293T细胞，按Μ0Ι值分为5个梯度：1、3、5、10和20;
[0097] 3)实验组使用上述构建的慢病毒液，对照组使用标准病毒液（lxl01()if U/ml);
[0098] 4)感染24小时后，通过倒置荧光显微镜观察GFP表达情况，与对照组比较确定病毒 滴度:计算荧光细胞比例在10 %左右的荧光细胞个数，病毒滴度=表达GFP细胞数量X慢病 毒颗粒梯度稀释倍数。
[0099]实施例4转染人肝星状细胞株LX2
[0100] 1)培养人肝星状细胞LX2，将细胞悬液接种于12孔板中，37 °C 5 % C02培养箱培养；
[0101] 2)待细胞融合度达30%至40%时，将细胞分为两组:①阴性对照组：阴性对照慢病 毒颗粒感染细胞;②Lenti-shRNA-R-Spondin2实验组:使用上述构建的shRNA-R-Spondin2 慢病毒载体感染细胞；
[0102] 3)根据不同的Μ0Ι值，加入适宜量病毒，12小时后观察细胞状态，未出现明显细胞 毒性作用，继续培养48小时后更换培养基;若有明显细胞毒性，立即更换培养基；
[0103] 4)感染4至5天后观察慢病毒报告基因 GFP表达情况，感染效率低于50 %者，重新进