针对哺乳动物R-Spondin1基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明设及生物技术领域，特别设及一种针对哺乳动物R-Spond in 1基因祀点的小 干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇 管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是W胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成 增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步则发展成肝硬化。肝纤维化是可逆 的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的 最佳措施。
[0003] 肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型 转换是肝纤维化发生的中屯、环节。肝星状细胞的激活受众多细胞因子的调控，现有研究结 果证实Wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断Wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及 诱导其调亡。但Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括细胞形态与功能的分化及维持、 免疫、细胞癌变与调亡，直接阻断该信号通路可能具有广泛的不良生物学效应。R-脊椎蛋白 I(R-Spondinl)是新发现的Wnt信号通路的重要调控因子，R-Spondinl可W激活并增强Wnt/ e-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成W及疾病发生过程中发挥重要作用。
[0004] RNA干扰(RNAi)是利用序列特异性的、与祀基因同源的双链RNA(dsRNA)对祀基因 转录后的信使RNA(mRNA)的分解，从而抑制祀基因表达的一种转录后基因沉默技术。其作用 机制是:dsRNA被Dicer酶识别，并被切割为小干扰RNA(SiRNA) DSiRNA与RNA介导沉默复合体 (RISC)结合后，识别并降解同源的mRNA，特异性抑制目的基因的表达。由于RNA干扰抑制祀 基因表达具有特异性强、快速、高效等优点，尤其适合特异祀向性的基因治疗。
[0005] 最初RNA干扰采样体外合成SiRNA的方法，但存在转染效率低、转移到细胞内的 SiRNA不能持久性表达、对祀基因表达的抑制作用短暂等缺点，从而限制了其应用。将SiRNA 合成为短发卡RNA(ShRNA)并由载体导入细胞，能在细胞内稳定的转录生成shRNA，并进一步 加工生成祀基因特异性的SiRNA,可W发挥长期抑制祀基因表达的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是基于RNA干扰技术抑制R-Spondinl基因表达，使激活的肝星状细 胞回退到静止状态或调亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[000引根据GeneBank公布的人R-Spondinl蛋白基因的cDNA序列，应用SiRNA设计原则，设 计siRNA-R-Spondinl序列，经Blast比对，序列的特异性好。所述SiRNA设计原则包括:革己位 点在AA序列之后，GC碱基含量大于45%，长度在19-23个bp等。
[0009] 基于上述原则设计的一种针对哺乳动物R - S P 0 n d i n 1基因祀点的小干扰R N A (siRNA-R-Spondinl)，包含正义链和反义链，其中：
[0010] 正义链序列为5 --GCCAUAACUUCUGCACCAA-3-，如沈Q ID N0:1 所示；
[0011] 反义链序列为5 --抓661]6〔464461]1^1]66(：-3-，如沈9 10備:2所示。
[0012] 所述的哺乳动物为人。
[0013] 一种所述的小干扰RNA的用途，即所述的小干扰RNA通过化学合成法合成短发卡 RNA。
[0014] 根据所述SiRNA-R-Spondinl序列，应用ShRNA设计原则，设计ShRNA-R-Spondinl序 列。所述shRNA-R-Spondinl的两端带化nd III和BamH I酶切位点，中间loop接头序列为5'-TCAAGAG-3 '，尾部带有RNA聚合酶III终止子TTTTTT。所述的ShRNA设计原则包括:序列5'端 带限制性酶切位点，酶切位点下方紧连一个C，目的序列的第一个碱基为G，loop接头序列 应在ShRNA序列中间，不能出现连续3个W上的T。
[001引本发明的另一目的在于提供一种由所述的小干扰RNA合成的短发卡RNA(shRNA-R-Spondinl)，包含正义链和反义链，其中：
[0016] 正义链序列为
[0017] 5'-GATCCCCGCCATAACTTCTGCACCAATCAAGAGTTGGTGCAGAAGTTATGGCTTTTTTGGAAA-3 ―，如沈Q ID NO:3所示；
[0018] 反义链序列为
[0019] 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCCATAACTTCTGCACCAACTCTTGATTGGTGCAGAAGTTATGGCGGG-3 ―，如沈Q ID NO:4所示。
[0020] 所述ShRNA-R-Spondinl序列可由化学合成法合成。在肝纤维化的基因治疗中，本 发明的化学合成片段可能会经多种化学方法进行修饰W增加稳定性和祀向性。
[0021] 本发明的另一目的在于提供一种含有所述的短发卡RNA的载体，其中所述的短发 卡RNA与病毒表达载体或非病毒表达载体相连。所述病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒 载体。所述非病毒表达载体为质粒载体。
[0022] 即所述ShRNA序列可由多种载体导入细胞，包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载 体和逆转录病毒等。如将上述ShRNA-R-Spondinl合成〇1 igo DAN单链片段并退火形成双链 DNA，其两端含酶切位点粘端，连入酶切后的载体质粒，构建的shRNA-R-Spondinl质粒载体。 或将ShRNA-R-Spondinl与慢病毒载体质粒进行酶切并连接，并与骨架质粒、慢病毒包装质 粒共转染293T细胞，培养液离屯、形成浓缩病毒液，得到慢病毒载体Lenti-ShRNA-R-Spondinl〇
[0023] 本发明还提供了所述的短发卡RNA的载体在制备肝纤维化基因治疗药物中的应 用。
[0024] 经实验证明，本发明设计的SiRNA-R-Spondinl能有效抑制人肝星状细胞LX2中R-Spondinl基因的表达，降低了 Wnt信号通路的活性，促使肝纤维化的标志物a-SMA和 Collagen I的表达降低，抑制了人肝星状细胞LX2的增殖并使其恢复存储油脂功能。表明本 发明设计的针对R-Spondinl基因祀点的RNA干扰片段能促使激活的肝星状细胞回退到静止 状态或调亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
【附图说明】
[00巧]图I为pG化-GFP载体结构体。
[00%] 图2为Lenti-ShRNA-R-Spondinl慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制R-Spondinl蛋白表达与mRNA水平。A.Western blot检测R-Spondinl蛋白表达；B.Real-time PCR 检测 R-Spondinl 的 mRNA 水平。
[0027] 图3为免疫巧光检测Lenti-ShRNA-R-Spondinr區病毒载体转染人肝星状细胞LX2 后，抑制肝纤维化标志物Q-SMA和Collagen I的表达。
[0028] 图4为Lenti-ShRNA-R-Spondinl慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2后，抑制肝纤维 化标志物日-SMA和Collagen I蛋白及mRNA的表达。A.Western blot检测a-SMA和Collagen I 蛋白表达;B.Rea^time PCR检测a-SMA和ColIagen I的mRNA水平。
[00巧]图5A.油红0染色检测Lenti-ShRNA-R-Spondinl慢病毒载体转染人肝星状细胞LX2 后，LX2恢复油脂存储状态;B. MTT法检测Lent i-shRNA-R-Spondinr區病毒载体转染人肝星 状细胞LX2后，LX2增殖率下降。
【具体实施方式】
[0030] W下通过具体实施例对本发明作进一步说明。W下实施例仅用于说明本发明，而 不用于限定本发明的范围。W下实施例中所设及的技术，包括细胞培养、载体构建、细胞转 染、克隆、基因测序、Western blot检测、PCR扩增与检测、免疫巧光等分子生物学技术，除非 特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂、质粒、细 胞株等，除非特别注明，均为一般本领域的技术人员可W通过公共途径获得。
[0031] 实施例1 SiRNA序列设计
[0032] 应用SiRNA设计的原则（Petri S, SiRNA design priciples and off-target effects .Methods Mol Biol. 2013; 986:59-71)筛选SiRNA序列：（I)从转录本(mRNA)的AUG 起始密码开始，寻找"AA"二连序列，并记下其3'端的19-23个碱基序列作为SiRNA的候选祀 位点；（2)SiRNA序列的GC含量在45%至55%之间；（3)长度在19-23个bp; (4)不含反向重复 序列；（5)没有连续9个W上的GC序列；（6)正义链的5'端最好为G/C;(7)反义链的5'端最好 为A/U; (8)正义链的15-19碱基最好含有3个W上A/U; (9)反义链的5'端7个碱基中最好有5 个W上A/U。
[0033] 使用Blast(www.ncbi .nlm.nig.