行感染;感染效率大于50 %者继续培养，然后收集细胞作进一步检测。
[0104] 实施例5实时RT-PCR检测
[0105]如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细 胞LX2，Real-time PCR检测LX2中R-Spondin2和肝纤维化标志物a-SMA、Collagen-I的mRNA 水平。1)PCR引物如下所示 「01061
[0107] 2) Tr i zo 1 法提取总 RNA，-80 °C 保存；
[0108] 3)紫外分光光度计测定260nm和280nm波长处的吸光度值，计算提取的总RNA浓度； 4)用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA后，-20°C保存；
[0109] 5)PCR反应体系为： SYBR IjU'J i() uL 上游引物（l〇umol/L) 0.5 uL
[0110] 下游引物（10umol/L) 0 5uL 样品 cDNA 2uL 双蒸水 7uL
[0111] 在ABI 7500PCR仪上进行反应；
[0112] 6) PCR条件:95 °C 4分钟，1个循环;95 °C 30秒，60 °C 45秒，72 °C 1分钟，共35个循环;72 °C延伸5分钟；
[0113] 7)用SDS软件进行数据分析，用比较Ct值的方法分析结果，目的基因的表达量由β-actin进行标准化。
[0114] Real-time PCR检测显示，与对照组相比，Lenti-shRNA-R_Spondin2显著下调人肝 星状细胞LX2中的R-Spondin2(参见图2)和肝纤维化标志物a-SMA、Collagen-I(参见图4)的 mRNA水平。表明本发明所设计的RNA干扰片段沉默了 R-Spondin2靶基因的表达，从而抑制的 肝星状细胞的激活。
[0115] 实施例6 Western blot检测
[0116] 如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细 胞LX2，Western blot法检测LX2中R_Spondin2蛋白和肝纤维化标志物a-SMA、Collagen_I 蛋白的表达。
[0117] 1)RIPA裂解液提取人肝星状细胞LX2的总蛋白；
[0118] 2)用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度，最后根据标准曲线计算蛋白浓度；
[0119] 3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭后，分别加入R-Spondin2抗 体(1:1000)、a-SMA抗体(1:300)和Collagen I抗体(1:1000)，4°C孵育过夜；
[0120] 4)洗膜后加入二抗(1:2000)，室温孵育2小时后电化学发光试剂检测；
[0121] 5 )i3_actin蛋白为内参照，凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司）对各条带的灰度 值进行分析。
[0122] Western blot法检测显示，与对照组相比，Lenti-shRNA-R_Spondin2显著下调人 肝星状细胞LX2中的R-Spondin2蛋白（参见图2)和肝纤维化标志物α-SMA蛋白、Co 1 lagen-I 蛋白（参见图4)的表达。表明本发明所设计的RNA干扰片段下调了R-Spondin2靶基因的表 达，从而抑制肝星状细胞的激活。
[0123] 实施例7免疫荧光检测
[0124] 如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细 胞LX2,免疫荧光法检测LX2中R-Spondin2蛋白和肝纤维化标志物α-SMA的表达。
[0125] 1)对慢病毒转染的人肝星状细胞LX2，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每 次10分钟，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15分钟；
[0126] 2)PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后在4°C条件下，用0.1 %Triton X-100透膜15 分钟；
[0127] 3)PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后在室温条件下，用4%BSA封闭细胞30分钟；
[0128] 4)按1:100的比例分别稀释各一抗(R-Spondin2和a-SMA)，然后将其放在4°C冰箱 中孵育过夜；
[0129 ] 5) PBS冲洗细胞3次，每次10分钟，按1:100的比例稀释相应二抗，37 °C条件下放置1 小时；
[0130] 6)用PBS冲洗3次，每次10分钟，最后DAPI染细胞核并用荧光显微镜拍照。
[0131] 免疫荧光显示(参见图3)，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2明显降低了人 肝星状细胞LX2中R-Spondin2蛋白和a-SMA蛋白的表达。表明本发明所设计的RNA干扰片段 下调了 R-Spondin2靶基因的表达，从而抑制了肝星状细胞的肝纤维化发展。
[0132] 实施例8油红0染色检测
[0133] 如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细 胞LX2，油红0染色法检测LX2中油脂的储存状况。
[0134] 1.染料的配制
[0135] Oil Red 0 0.5g溶于 100ml异丙醇。
[0136] 2.染色步骤
[0137] 1)稀释，染料同蒸馏水按3:2稀释；
[0138] 2)过滤，通过定性滤纸过滤；
[0139] 3)固定，吸弃培养液后加入固定液5分钟；
[0140] 4)吸弃固定液，加入染色液15分钟后水洗一次镜检观察；
[0141] 5)苏木晶复染；
[0142] 6)水冲洗至变蓝后观察并拍照。
[0143] 油红0染色显示（参见图5)，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2明显增强了 人肝星状细胞LX2中油脂的存储。表明本发明所设计的RNA干扰片段抑制了R-Spondin2靶基 因的表达，从而促使激活的肝星状细胞向静止状态转化。
[0144] 实施例9 MTT增殖检测
[0145] 如实施例4所述，将构建的Lenti-shRNA-R-Sp〇ndin2慢病毒载体转染人肝星状细 胞LX2，MTT法检测LX2的增殖情况。
[0146] 1)人肝星状细胞LX2接种于96孔培养板，每孔细胞密度为4X 103;
[0147] 2)如实施例4所述，转染Lenti-shRNA-R-Spondin2慢病毒载体；
[0148] 3)在转染后24小时、48小时和72小时，每孔加入10yL MTT液体；
[0149] 4)37°(：孵育4小时，每孔加入10(^01^0，充分摇匀；
[0150] 5)用酶标仪，以570nm的波长进行吸光度检测，计算细胞存活率。
[0151] MTT增殖检测显示（参见图5)，与对照组相比，Lenti-shRNA-R-Spondin2明显降低 了人肝星状细胞LX2的增殖。表明本发明所设计的RNA干扰片段抑制了 R-Spondin2靶基因的 表达，从而抑制了肝星状细胞的增殖。
【主权项】
1. 一种针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA，所述小干扰RNA包含正义链和 反义链，其特征在于其中： 正义链序列为5'-GUUGGUCAUUGGAGCGAAU-3'，如SEQ ID N0:1 所示； 反义链序列为5'-AUUCGCUCCAAUGACCAAC-3'，如SEQ ID N0:2所示。2. 如权利要求1所述的小干扰RNA序列，其特征在于，所述的哺乳动物为人。3. -种如权利要求1所述的小干扰RNA的用途，其特征在于，所述的小干扰RNA通过化学 合成法合成短发卡RNA。4. 一种由权利要求1所述的小干扰RNA合成的短发卡RNA，所述短发卡RNA包含正义链和 反义链，其特征在于其中： 正义链序列为 5'-GATCCCCGTTGGTCATTGGAGCGAATTCAAGAGATTCGCTCCAATGACCAACTTTTTTGGAAA-3'，如 SEQIDN0:3K*; 反义链序列为 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGTCATTGGAGCGAATCTCTTGAATTCGCTCCAATGACCAACGGG-3'，如 SEQIDN0:4**。5. -种含有如权利要求4所述的短发卡RNA的载体，其特征在于，所述的短发卡RNA与病 毒表达载体或非病毒表达载体相连。6. 如权利要求5所述的载体，其所述病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体。7. 如权利要求5所述的载体，其所述非病毒表达载体为质粒载体。8. 如权利要求5所述的含有短发卡RNA的载体在制备肝纤维化基因治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用。所述小干扰RNA包含正义链和反义链。基于该小干扰RNA可通过化学合成法合成短发卡RNA。短发卡RNA可进一步与病毒表达载体或非病毒表达载体相连，形成一种针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的载体。其中病毒表达载体为慢病毒载体或腺病毒载体，非病毒表达载体为质粒载体。上述的短发卡RNA的载体可用于制备肝纤维化基因治疗药物。本发明设计的针对R-Spondin2基因靶点的RNA干扰片段能促使激活的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/63, A61K48/00, A61P1/16, C12N15/113
【公开号】CN105624162
【申请号】CN201610165169
【发明人】虞玲华, 殷新光
【申请人】嘉兴市第一医院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月19日