专利名称：一种交替假单胞菌产低温碱性蛋白酶的方法及产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分离自连云港海域的交替假单胞菌HH407菌株CCTCCNOM 2070009(已于2007年1月29日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NOM 207009)；本发明还涉及该菌株产低温碱性蛋白酶的方法及产品。
背景技术：
低温酶在低温下有着比中温酶更高的催化效率，能起到工业加工中降低能耗的作用，因此在洗涤剂、纺织工业、食品工业、酿造和白酒工业、饲料加工、生物转化及环境生物治理等方面具有广泛的应用前景。从海洋微生物中筛选具有应用价值的低温酶类，已成为海洋生物资源开发的重要途径。
碱性蛋白酶是加酶洗涤剂的主要添加剂，目前洗衣粉中主要添加的是中温碱性蛋白酶。这类酶一般最适酶活通常在50℃以上，所以要达到最佳洗涤效果，就要加热水。而低温酶最适酶活一般在40℃以下，可以直接室温洗涤，节省能源，并在食品制造、制革、丝绸、环保、医药等领域显示出广泛的应用前景。
国内外对低温碱性蛋白酶的研究报道较多，其产酶菌株主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)和弧菌属(Vibrio)。目前国内外均没有Pseudoalteromonas.flavipulchra产低温碱性蛋白酶的文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，通过选育一种新的海洋嗜冷菌交替假单胞菌属，flavipulchra菌来生产低温碱性蛋白酶，本发明所要解决的另外的技术问题是研究该菌株的生长特性，及其产低温碱性蛋白酶的方法和酶的产品。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
本发明的特征包括交替假单胞菌HH407(Pseudoalteromonas flavipulchraHH407)菌株本身，以及利用该菌株产低温碱性蛋白酶的方法，以及利用该菌株所产的低温碱性蛋白酶产品。
本发明所涉及的菌株是一株分离自连云港海域的海洋细菌嗜冷菌交替假单胞菌HH407(Pseudoalteromonas，flavipulchra HH407)，并于2007年1月29日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，其保藏编号为CCTCC NOM 207009。
一、本发明菌株的特征和生长特性1、形态观察分别对菌株进行光学显微镜和电镜(南京农业大学)观察。
2、菌株的生长特性2.1种子液的制备将保藏在2216E培养基的斜面菌株接种到发酵培养基中，转速180r/min，装液量20％，培养16h。
2.2温度对生长的影响种子液2％接种于发酵培养基，pH自然，转速180r/min，装液量20％，分别在不同温度下培养，测定细胞浓度。
2.3 pH对生长的影响在发酵培养基中加入下列不同的缓冲液(10mM)，在分别调节发酵培养基的pHpH 5.0-6.0(MES)，pH 7.0(PIPES)，pH 7.5-8.5(HEPES)，pH 9.0-11.0(不加缓冲液)，在20℃培养24小时，其他条件同2.2，测定细胞浓度。
2.4 NaCl对生长的影响在发酵培养基(将用海水配置改用微量矿物盐溶液代替，每升培养基加入10ml)中加入NaCl，使之为0％到13％的NaCl，在20℃培养24小时，其他条件同2.2，测定细胞浓度。
2.5对碳氮源的利用碳源实验在基本培养基中加入不同的终浓度为0.5％的碳源物质(糖类、有机酸类、醇类及氨基酸类)代替葡萄糖；氮源实验在基本培养基中加入不同的终浓度为0.2％的氮源物质(酵母膏等)代替蛋白胨。对照为基本培养基，20℃、180r/min振荡培养，每隔12h测定细胞浓度，直至测定细胞浓度下降为止。
2.6细胞浓度的测定采用petroff-Hausser细菌计数板在Olympus相差显微镜测定。
3、关于本发明中的培养基。
2216E培养基(g/L)蛋白胨5，酵母粉1，海水配置，pH8.5；酪蛋白培养基(g/L)干酪素10，海水配置，pH10.0；基本培养基(g/L)蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，海水配置，pH8.5；发酵培养基(g/L)蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖5，海水配置，pH8.5微量矿物盐(每升)CuSO4·5H2O，0.01g；ZnSO4·7H2O，0.1g；CoCl2·6H2O，0.005g；MnCl2·4H2O，0.2g；Na2MoO4·2H2O，0.1g；KBr，0.05g；KI，0.05g；H3B03，0.1g；NaF，0.05g；LiCl，0.05g；Al2(SO4)3，0.05g；NiCl2·6H2O，0.01g；VoSO4·2H2O，0.005g；H2WO4·2H2O，0.002g；Na2SeO4，0.005g；SrCl·6H2O，0.005g；BaCl2，0.005g.
4、菌株的形态特征和生长特性4.1菌株的形态特征菌株为需氧的革兰氏阴性杆菌，无芽孢，无荚膜，端生单鞭毛，大小为0.4-0.7μm×1.0-1.8μm(图1)。菌株在酪蛋白平板20℃培养4d后，菌落直径3mm-4mm，椭圆金黄色、湿润、边缘光滑、中间凹陷、四周隆起、半透明、易挑取，能产生明显的透明圈。图2是菌株的电镜图。
4.2温度、pH和NaCl对生长的影响该菌能够在0℃下缓慢生长，在15℃～20℃下快速生长，该菌的生长温度范围为0-35℃，最适生长温度为20℃；生长pH范围为5.5-11，最适生长pH为8.5；生长的NaCl浓度为0.5％-13％，最适生长的NaCl浓度为4％，无NaCl不生长。属于典型海洋嗜冷的中度嗜盐微生物(见图3、图4和图5)。
4.3菌株对碳氮源的利用。
HH407对碳氮源的利用结果见表1，HH407能很好的利用复杂蛋白质如胰蛋白胨、酵母膏，蛋白胨，其次是纤维二糖、淀粉、明胶，能利用有机酸(乙酸、柠檬酸)和醇类(甲醇、乙醇)，但对糖和氨基酸的利用能力较差。
表1 各种碳氮源物质对菌HH407的生长影响
二、菌株的鉴定
2.1菌株HH407的的生理生化反应菌株HH407的生理生化反应结果见表2氧化酶、接触酶均为阳性，不能发酵葡萄糖和利用聚-β-羟基丁酸盐，甲基红、VP、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱羧酶为阴性，不产生吲哚。HH407能利用蔗糖、半乳糖、柠檬酸盐、酪氨酸、丙酮酸，而不能利用麦芽糖、蜜二糖。通过Bergey’s Manualof Systematic Bacteriology(second edition)分析比较，初步判定该菌株为Pseudoalteromonas属。属内其它菌落产黄色色素种间的比较结果见表3，结果显示HH407同P.flavipulchra的特征基本一致。
表2 生理生化特性
+positive；-negative.
表3 菌株同交替假单胞菌属菌落产黄色色素的其它种的特性比较
+positive；-negative；NDNot determined.
2.2 16S rRNA PCR扩增和序列分析采用Takara试剂盒提出高纯度细菌的基因组DNA。正向引物P15′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物P25′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′。反应体系50μl，Taq酶2U。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次，72℃延伸7min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，所测序列提交GenBank进行同源性比较。
2.3菌株HH407的系统发育树构建选取同源性为95-99％的相关序列，采用MEGA3.1软件的邻接法构建出进化树，并用自举分析法进行置信度检测，自举数据集1000次。
2.3将HH407菌株的16S rDNA序列(GenBank的注册号为EF136442)同NCBI数据库中的序列进行同源性比较。Blast分析显示该菌属于交替假单胞菌属，同源性在95％以上，进化树分析与Pseudoalteromonas.ftavipulchra有99.9％的同源性且处在同一分支上，初步判定与Pseudoalteromonas flavipulchra为同种，此菌株命名为Pseudoalteromonas flavipulchra HH407。Pseudoalteromonas作为一个新分类的海洋细菌属(1995)，国内研究才刚刚起步，而Pseudoalteromonas flavipulchra作为2002年报道的新分类的种，国内外均未有相关实验报道三、菌株产低温碱性蛋白酶的方法接菌株HH407斜面1环菌放入50ml发酵培养基的250ml三角瓶，180r/min，20℃，培养16h。按2％接种量接入发酵培养基中，180r/min，20℃，培养36h。将培养好的发酵液10000r/min，离心10min，上清液加入60％硫酸铵，静置3h后，10000r/min离心30min，用Tris缓冲液(pH8.0)溶解，然后4℃透析24h，当中换透析液(Tris pH8.0，20mmol)4次，-40℃冻藏保存备用，再经过DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法得到低温碱性蛋白酶。
四、低温碱性蛋白酶的性质4.1酶作用温度对酶活性的影响选择0～70℃范围内测定不同温度下的酶活力，结果见图6，最适酶作用温度为35℃，酶在低温时仍然保持一定的酶活力，酶活下降缓慢，在0℃仍有22％的催化效率。
4.2酶的热稳定性将酶液分别在25℃～65℃温度条件下水浴保温不同时间，与未被保温处理的酶活力相比较，测定蛋白酶残留活力，结果见图7，酶在45℃以上热稳定性较差，55℃保温30min损失55％的酶活，65℃保温10min酶活全部丧失。酶在25℃、35℃、45℃非常稳定，保温60min，酶活均在80％以上。
4.3酶作用pH对酶活性的影响将酶液在各pH值的条件下检测酶活力，缓冲液(浓度均为50mM)为磷酸氢二钠-柠檬酸(pH5.0～8.0)，Tris-HCl(pH7.5～8.5)，Glycine(pH8.5～10.5)，以及NaOH-磷酸氢二钠(pH11.0～12.0)，4℃保存1h～2h后测定活力。结果如图8，酶的最适作用pH为10.0，在pH9.0-11酶活力较高，相对酶活力在80％以上，作用pH范围非常广，pH5-12均有酶活。
4.4酶pH稳定性缓冲液同4.3，30℃保温30min后测定酶活力，以未保温的酶液为对照，所的结果如图9，在pH9.0时酶稳定性最好。
4.5金属离子对酶活性的影响将酶液与金属离子混合，使反应液中的金属离子浓度为5mM，35℃保温30min后测定各种离子体系下的酶活，以不加金属离子的为对照，计算相对活力。结果见表4，Sr2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、K+对酶有激活作用，其中以Mn2+、Cu2+最为明显；Mg2+、Na、Ca2+、Ag+、Pb2+作用不显著；Ni2+、Co2+、Fe3+、Li2+有抑制作用，Hg2+、Al3+、Zn2+强烈抑制酶活力。
表4 金属离子对蛋白酶活力影响
4.6抑制剂、有机溶液、变性剂对酶活性的影响将酶液与各种抑制剂混合，35℃保温30min后测定酶活，计算相对活力。结果见表5。PMSF强烈抑制酶活，EDTA仍有106.6％的酶活，表明它是一种丝氨酸蛋白酶。H2O2(1％)，β-Mercaptoethanol(2mM)，Urea(2M)and DTT(10mM)能够提高酶活(分别提高4.8％、8.2％、20.1％、83.3％)，对SDS有很强的耐受性，0.1％SDS对酶活无影响，表面活性剂(Tween20、Tween80、Triton X-100)对酶活有稍微的促进作用。
表5抑制剂、有机溶液、变性剂对蛋白酶活力影响
5、蛋白酶酶活测定。
5.1蛋白酶酶活测定方法蛋白酶活性采用Folin法测定。
5.2酶活力单位定义为在35℃、pH10.0的条件下，每毫升酶液每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的酶量为1个单位(U/mL)。
五、低温碱性蛋白酶产品的应用。
本发明所述的低温碱性蛋白酶可作为加酶洗涤剂的主要添加剂，可以直接室温洗涤，节省能源。本发明低温碱性蛋白酶在食品制造、制革、丝绸、环保、医药等领域也具有广泛的应用前景。
图1为菌株光学显微镜图(10×100)。
图2为菌株的电镜图。
图3为温度对菌株生长的影响图。
图4为pH对菌株生长的影响图。
图5为NaCl对菌株生长的影响图。
图6为酶作用温度对酶活性的影响图。
图7为酶的热稳定性图。
图8为酶作用pH对酶活性的影响图。
图9为酶pH稳定性图。
具体实施例方式
实施例1。一种交替假单胞菌HH407(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)CCTCC NOM 207009。该菌株具有以下特征该菌能够在0℃下生长，该菌的生长温度范围为0-35℃，最适生长温度为20℃；生长pH范围为5.5-11，最适生长pH为8.5；生长的NaCl浓度为0.5％-13％，最适生长的NaCl浓度为4％，无NaCl不生长，属于典型海洋嗜冷的中度嗜盐微生物；该菌能利用胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、纤维二糖、淀粉、明胶、乙酸、柠檬酸、甲醇和乙醇。
实施例2。一种利用实施例1所述的一种交替假单胞菌HH407 CCTCCNOM 207009产低温碱性蛋白酶的方法，其步骤如下，(1)接菌株斜面1环菌放入50ml发酵培养基的250ml三角瓶，180r/min，20℃，培养16h；按2％接种量接入发酵培养基中，180r/min，20℃，培养36h；(2)将培养好得发酵液10000r/min，离心10min，上清液加入60％硫酸铵，静置3h后，10000r/min离心30min，用适量pH为8.0的Tris缓冲液溶解，然后4℃透析24h；再经过DEAE-sepharose Flat Flow和SephacrylS-200方法得到低温碱性蛋白酶。
实施例3。一种实施例2所述方法所产低温碱性蛋白酶，该低温碱性蛋白酶具有以下特征(1)酶最适作用温度为35℃，在0℃仍有22％的催化效率；酶在25℃、35℃、45℃稳定，保温60min，酶活均在80％以上，55℃保温30min损失55％的酶活；是一种低温的蛋白酶；(2)酶的最适作用pH为10.0，在pH9.0-11相对酶活力在80％以上，pH5-12均有酶活；酶的最稳定pH为9.0；是一种碱性的蛋白酶；
(3)Sr2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、K+对酶有激活作用，Hg2+、Al3+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Li2+有抑制作用；(4)PMSF抑制酶活，EDTA仍有106.6％的酶活，表明它是一种丝氨酸蛋白酶；H2O2、β-Mercaptoethanol、Urea和DTT能提高酶活，分别提高4.8％、8.2％、20.1％、83.3％，酶对SDS有耐受性，0.1％SDS对酶活无影响，表面活性剂Tween20、Tween80、Triton X-100对酶活有促进作用。
权利要求
1.一种交替假单胞菌HH407(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)CCTCC NOM 207009。
2.根据权利要求1所述的一种交替假单胞菌HH407 CCTCC NOM207009，该菌株具有以下特征该菌能够在0℃下生长，该菌的生长温度范围为0-35℃，最适生长温度为20℃；生长pH范围为5.5-11，最适生长pH为8.5；生长的NaCl浓度为0.5％-13％，最适生长的NaCl浓度为4％，无NaCl不生长，属于典型海洋嗜冷的中度嗜盐微生物；该菌能利用胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、纤维二糖、淀粉、明胶、乙酸、柠檬酸、甲醇和乙醇。
3.一种利用权利要求1或2所述的一种交替假单胞菌HH407 CCTCCNOM 207009产低温碱性蛋白酶的方法，其特征在于，其步骤如下，(1)接菌株斜面1环菌放入50ml发酵培养基的250ml三角瓶，180r/min，20℃，培养16h；按2％接种量接入发酵培养基中，180r/min，20℃，培养36h；(2)将培养好得发酵液10000r/min，离心10min，上清液加入60％硫酸铵，静置3h后，10000r/min离心30min，用适量pH为8.0的Tris缓冲液溶解，然后4℃透析24h；再经过DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法得到低温碱性蛋白酶。
4.一种按权利要求3所述方法所产低温碱性蛋白酶，其特征在于，该低温碱性蛋白酶具有以下特征(1)酶最适作用温度为35℃，在0℃仍有22％的催化效率；酶在25℃、35℃、45℃稳定，保温60min，酶活均在80％以上，55℃保温30min损失55％的酶活；是一种低温的蛋白酶；(2)酶的最适作用pH为10.0，在pH9.0-11相对酶活力在80％以上，pH5-12均有酶活；酶的最稳定pH为9.0；是一种碱性的蛋白酶；(3)Sr2+、Ba2+、Cu2+、Mn2+、K+对酶有激活作用，Hg2+、Al3+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Li2+有抑制作用；(4)PMSF抑制酶活，EDTA仍有106.6％的酶活，表明它是一种丝氨酸蛋白酶；H2O2、β-Mercaptoethanol、Urea和DTT能提高酶活，分别提高4.8％、8.2％、20.1％、83.3％，酶对SDS有耐受性，0.1％SDS对酶活无影响，表面活性剂Tween20、Tween80、Triton X-100对酶活有促进作用。
全文摘要
一种交替假单胞菌HH407(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)CCTCCN0M 207009。该菌能够在0℃下生长，该菌的生长温度范围为0－35℃，最适生长温度为20℃；生长pH范围为5.5－11，最适生长pH为8.5；生长的NaCl浓度为0.5％－13％，最适生长的NaCl浓度为4％，无NaCl不生长，属于典型海洋嗜冷的中度嗜盐微生物；该菌能利用胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、纤维二糖、淀粉、明胶、乙酸、柠檬酸、甲醇和乙醇。本发明还公开了一种利用交替假单胞菌产低温碱性蛋白酶的方法及按该方法得到的低温碱性蛋白酶产品。该低温碱性蛋白酶可作为加酶洗涤剂的主要添加剂，可以直接室温洗涤，节省能源；且在食品制造、制革、丝绸、环保、医药等领域也具有广泛的应用前景。
文档编号C12R1/38GK101070526SQ20071002011
公开日2007年11月14日 申请日期2007年2月12日 优先权日2007年2月12日
发明者王淑军, 陈丽, 吕明生, 李丹, 李华钟, 陈建安, 杨锦宇 申请人:淮海工学院