一株产脂肽类表面活性的假单胞菌及用途
【专利摘要】本发明提供了一种产脂肽类表面活性的假单胞菌及使用该菌株生产的生物表面活性剂。本发明提供的生物表面活性剂可用于采油工业、环境生物修复领域和/或食品工业。
【专利说明】一株产脂肽类表面活性的假单胞菌及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株产脂肽类表面活性的假单胞菌及用途。
【背景技术】
[0002]生物表面活性剂主要是由微生物在好氧或厌氧条件下，在不同的碳源培养基中生长时产生的。其一般分为非离子性和阴离子型，阳离子型较为少见。根据结构特点，可将其分为5类:糖脂类、脂肽和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂类等五大类。
[0003]它具有增溶、高特异性、生物相容性、高生物降解能力、临界胶束浓度低和能显著降低界面张力等优点，尤其是其良好的生物相容性及对环境无毒害的特点，是化学表面活性剂所不具备的。因此，利用微生物表面活性剂来代替化学合成表面活性剂或作为其升级换代产品，有着巨大的社会、经济及生态效益。
[0004]目前，大多数已知道的生物表面活性剂都属于糖脂类。在糖脂中，人们最熟悉的是鼠李糖脂、海藻糖脂和槐糖脂。而脂肽类表面活性剂研究较少，目前脂肽类表面活性剂研究最多的是1968年，Arima等首次发现枯草杆菌(Bacillussubtilis) IFO 3039产生的脂肽类表面活性呈晶状，商品名为表面活性素(Surfactin)，也是迄今已报道的效果最好的表面活性剂之一。
[0005]其他脂肽类表面活性剂的研究主要有:短小芽孢杆菌(Bacillus brebvis)和多粘芽孢杆菌(B.polymyva)产生的很多环脂肽，都有很好地表面活性。假单胞菌(P.rubescens)和硫氧化硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)产生的含鸟氨酸的脂、腊状葡糖杆菌(Gluconobacter cerinus)IF03267产生的含鸟氨酸和牛磺酸的脂、膨胀土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) IFO` 3058产生的含赖氨酸的脂都具有很好的表面活性。
[0006]目前，脂肽类表面活性剂因其高表面活性和在医药方面的潜能日渐引起人们的重视，但目前已发现的脂肽类表面活性剂种类较少，且产量很低，无法工业化生产。因此，如何提高产量或开发一些新型的产量较高的表面活性剂是目前研发的主要目标。
【发明内容】
[0007]发明人经过长期而深入的研究，从中国新疆维吾尔自治区吐鲁番市东南艾丁湖中间土壤中筛选获得了一株假单胞菌，其生产的发酵液具有很好的排油活性。经检测，发现该假单胞菌的发酵液及从发酵液中纯化获得的生物表面活性剂具有良好的乳化活性和降低表面张力能力，广泛的pH范围，良好的抗盐性能，良好的临界胶束浓度等优点，其在采油工业、环境生物修复领域和食品工业等领域中具有重要应用前景。
[0008]因此，本发明的第一个目的在于，提供一种假单胞菌，其保藏号为CGMCCN0.6780。
[0009]本发明的第二个目的在于，提供该假单胞菌的发酵液，优选的，在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养所述的假单胞菌，以获得所述发酵液；更优选的，所述发酵液为发酵
上清液。[0010]本发明的第三个目的在于，提供制备前述发酵液的方法。
[0011]本发明提供的方法包括以下步骤:
[0012]在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养该假单胞菌，以获得所述发酵液。
[0013]优选的，所述方法还包括收集发酵上清液的步骤。
[0014]本发明的第四个目的在于，提供一种生物表面活性剂。
[0015]本发明提供了一种由所述假单胞菌产生的生物表面活性剂。
[0016]本发明还提供了一种生物表面活性剂，该表面活性剂为脂肽类表面活性剂，所述表面活性剂的氨基酸组成如下:
[0017]0.67%天冬氨酸，6.25%甘氨酸，0.76%酪氨酸，1.41%半胱氨酸，5.43%苯丙氨酸，
0.89%丝氨酸，45.46%脯氨酸，13.52%亮氨酸，3.82%丙氨酸，6.63%缬氨酸，12.34%异亮氨酸，1.1%赖氨酸，1.7%甲硫氨酸；
[0018]所述表面活性剂的CMC为30mg/L ；
[0019]所述表面活性剂为线性结构。
[0020]本发明的第五个 目的在于，提供制备该生物表面活性剂的方法。
[0021]本发明提供的方法包括以下步骤:
[0022]在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养该假单胞菌，并收集发酵上清液，以获得所述生物表面活性剂。
[0023]优选的，所述方法还包括纯化所述发酵上清液的步骤。更优选的，所述纯化包括以下步骤:1)调节所述发酵上清液的PH至1.8-2.5，收集沉淀；2)将步骤I)收集的沉淀干燥，获得所述表面活性剂；优选的，在干燥所述沉淀前，将沉淀的PH调节至6-8。
[0024]更优选的，在所述纯化步骤后还包括使用有机溶液洗涤所述表面活性剂的步骤；优选的有机溶液为二氯甲烷、氯仿、甲醇混合物、乙酸乙酯中的一种或多种，更优选的有机溶液为氯仿和甲醇中的一种或多种。
[0025]本发明的第六个目的在于，提供该假单胞菌用于制备生物表面活性剂的用途。
[0026]本发明的第七个目的在于，提供该发酵液作为生物表面活性剂的用途；优选的，所述发酵液为发酵上清液。
[0027]本发明的第八个目的在于，提供所述假单胞菌、发酵液或生物表面活性剂用于采油工业、环境生物修复领域和/或食品工业的用途。
[0028]本发明提供的菌株的发酵液以及本发明提供的脂肽生物表面活性剂具有很好的乳化活性和降低表面张力能力，广泛的PH范围，及良好的抗盐性能，可用于微生物采油、环境生物修复和食品工业等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]下面结合附图对本发明作进一步说明，其中以下附图显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
[0030]图1显示F2水解液的HPLC图谱。
[0031]图2显示不同稀释倍数的发酵液的表面张力。
[0032]图3显示表面活性剂的CMC检测结果。
[0033]图4显示不同pH下表面活性剂的表面张力。[0034]图5显示不同氯化钠浓度下表面活性剂表面张力。
[0035]图6显示表面活性剂对白油的乳化效果。
[0036]菌种保藏
[0037]本发明中所使用的假单胞菌株Pseudomonas.sp.D4于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.6780。
【具体实施方式】[0038]本发明提供了一种假单胞菌，该假单胞菌从中国新疆维吾尔自治区吐鲁番市东南艾丁湖中间土壤中筛选获得，其发酵液具有很好的排油活性。经进一步研究发现该假单胞菌的发酵液及从发酵液中纯化获得的生物表面活性剂还具有良好的乳化活性和降低表面张力能力，广泛的PH范围，良好的抗盐性能，良好的临界胶束浓度等优点，在采油工业、环境生物修复领域和食品工业等领域中具有重要应用前景。该假单胞菌命名为Pseudomonas.sp.D4，于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC N0.6780。
[0039]由于油田油藏地层水中含有较高的含盐量和二价阳离子，如果第三次采油用的表面活性剂驱油体系对盐比较敏感，就会产生絮凝或沉淀，致使驱油效果降低，并能堵塞地层流动孔道，造成地层不可逆转的损害，因此，在使用表面活性剂驱油之前首先要评价其耐盐性，需要选择具有良好耐盐性的表面活性剂。本发明提供了一种假单胞菌的发酵液，该发酵液具有良好的排油活性、乳化活性，降低表面张力能力，广泛的PH范围，良好的抗盐性能，良好的临界胶束浓度等优点。因此，特别适合用于采油工业，将该发酵液直接使用，不仅有利于采油作业，还可以达到降低生产成本的目的。此外，还可以用于环境生物修复领域、食品工业等领域。
[0040]优选的，本发明提供的发酵液，是在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养所述的假单胞菌而获得的发酵液。在另一个优选的实施例中，使用的发酵液为发酵上清液。
[0041]所述发酵上清液是该假单胞菌培养后除去菌体的培养液，其中含有该假单胞菌产生的生物表面活性剂。该发酵上清液同样具有良好的乳化活性和降低表面张力能力，广泛的PH范围，良好的抗盐性能，以及良好的临界胶束浓度等优点。因此，特别适合用于采油工业，将该发酵液直接使用，不仅有利于采油作业，还可以达到降低生产成本的目的。此外，还可以用于环境生物修复领域、食品工业等领域。
[0042]本发明还提供了一种制备所述发酵液的方法。该方法包括以下步骤:
[0043]在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养所述的假单胞菌，以获得所述发酵液；优选的，所述方法还包括收集发酵上清的步骤。
[0044]对本领域的技术人员而言，收集发酵上清液的方法是常规的，包括但不限于离心、过滤、静置等方法，上述方法的具体参数，如离心速度、离心时间等可根据情况进行合理选择，也可将上述方法组合使用。
[0045]本发明还提供了一种生物表面活性剂，该生物表面活性剂由假单胞菌产生。该表面活性剂为一种脂肽类生物表面活性剂，其具有很好的乳化活性和降低表面张力能力，广泛的PH范围，及良好的抗盐性能。可将其用于采油工业，环境生物修复领域、食品工业等领域。[0046]本发明还提供了一种生物表面活性剂，该表面活性剂为脂肽类表面活性剂，所述表面活性剂的氨基酸组成如下:
[0047]0.67%天冬氨酸，6.25%甘氨酸，0.76%酪氨酸，1.41%半胱氨酸，5.43%苯丙氨酸，
0.89%丝氨酸，45.46%脯氨酸，13.52%亮氨酸，3.82%丙氨酸，6.63%缬氨酸，12.34%异亮氨酸，1.1%赖氨酸，1.7%甲硫氨酸；
[0048]所述表面活性剂的CMC为30mg/L ;[0049]所述表面活性剂为线性结构。
[0050]该表面活性剂为一种脂肽类生物表面活性剂，其具有很好的乳化活性和降低表面张力能力，广泛的PH范围，及良好的抗盐性能。可将其用于采油工业，环境生物修复领域、食品工业等领域。
[0051]本发明还提供了制备所述生物表面活性剂的方法。本发明提供的方法包括以下步骤:
[0052]在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养权利要求1所述的假单胞菌，并收集发酵上清，以获得所述生物表面活性剂；优选的，所述方法还包括纯化所述发酵上清的步骤。
[0053]在本发明的一个实施例中，采用下述方法纯化发酵上清:
[0054]I)调节所述发酵上清液的pH至1.8-2.5，收集沉淀；
[0055]2)将步骤I )收集的沉淀干燥，获得所述表面活性剂；优选的，在干燥所述沉淀前，将沉淀的pH调节至6-8。
[0056]由于所述表面活性剂为脂肽类生物表面活性剂，其在不同pH下溶解性存在差异。发明人发现，在PH为1.8-2.5时，该表面活性剂的溶解性最低，因此，将发酵液调节至其附近时，可最大量的获得该表面活性剂沉淀。在本发明的一些实施例中，将PH调节为1.8，
1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4或2.5，收集沉淀。在本发明的另一些实施例中，在pH调节至
1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7 或 2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5 后，收集沉淀。对本领域的技术人员而言，收集沉淀的方法是常规的，如可采用离心、静置、过滤等方法，也可将上述方法进行组合使用。收集获得的沉淀可直接干燥，也可将沉淀的PH调节至合适的范围，如PH4-5，pH6-8，pH5_6，pH8_9或pH9_ll后进行干燥，以获得所需的表面活性剂。
[0057]在本发明的一些实施例中，所述方法还进一步包括在所述纯化步骤后使用有机溶剂或其溶液洗涤所述表面活性剂的步骤；使用有机溶剂或其溶液可将去除杂质，以获得更纯的表面活性剂。对本领域的技术人员而言，可以采用的洗涤的方法和使用的有机溶剂均是常规的，可根据需要进行调整和组合。在本发明的一些实施例中，使用的所述有机溶剂包括:二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸乙酯中的一种或多种；在本发明的另一些实施例中，使用的所述有机溶剂选自氯仿、甲醇或它们的组合。
[0058]在本发明中，可使用所述的假单胞菌制备其发酵液或进一步制备生物表面活性剂。
[0059]在本发明中，可将获得的发酵液直接作为生物表面活性剂使用，例如在采用工业中，可将本发明提供的发酵液作为表面活性剂直接进行驱油，也可将本发明提供的发酵液用于环境生物修复领域、食品工业。
[0060]由于发酵液中还包含有菌体，因此，在一些情况下，为操作方便，可将发酵液中的菌体去除，而仅使用发酵液上清。在本发明的一些实施例中，使用的所述发酵液即为去除了菌体的发酵上清。
[0061]本发明还进一步提供了将所述假单胞菌、所述的发酵液或所述的生物表面活性剂用于采油工业、环境生物修复领域和/或食品工业的用途。
[0062]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上
由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”
属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0063]可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0064]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
[0065]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。以下实施例中所有试剂都可来源于市售，例如，本发明所用的培养基成分均可购自国药集团化学试剂有限公司。
[0066]除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中`。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0067]出发菌株来源、选育、鉴定和保藏
[0068]1、采样
[0069]本发明所提供的假单胞菌菌株Pseudomonas.sp.D4分离自中国新疆维吾尔自治区吐鲁番市东南艾丁湖中间土样。
[0070]2.筛选
[0071]称取土样10g，加入生理盐水90ml，220r/min摇床震荡2h，静止30min后取上清液IOml接种装有50ml富集培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180rpm/min震荡培养3d。
[0072]将液体富集培养液用无菌生理盐水稀释105，IO6, IO7倍，每个稀释度取0.1ml菌液涂布于平板富集平板上，于30°C静止培养4d。将平板富集培养基上有嗜油斑的菌落，进一步在平板分离培养基上划线分离纯化，挑取单菌落保藏在斜面保藏培养基上。
[0073]将培养成熟的斜面菌株接种到发酵培养基中，28°C、200rpm震荡培养72h，通过测定发酵液的排油活性筛选出产表面活性剂能力强的菌株，命名为D4。
[0074]该菌的生长状态和形态学特征如下:
[0075]菌株D4在LB培养基上28°C培养72小时，菌落白色、圆形、隆起、不透明、表面光滑、湿润。
[0076]16S rDNA 序列分析
[0077]测得假单胞菌D4的16S rDNA序列长度为1297bp，具体见SEQ ID N0.1所示。将所测序列在RDP数据库对比分析，构建系统进化树。结果表明菌株D4属于假单胞菌属。
[0078]将该假单胞菌Pseudomonas.sp.D4于2012年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.6780。
[0079]在本发明的下述实施例中，使用的
[0080]液体富集培养基:橄榄油3.0g/L, NaCl 3.0g/L, NH4Cl 0.lg/L，MgSO40.02g/L,NaNO30.2g/L, KH2PO40.lg/L, K2HPO40.2g/L, pH 7.0，于 121。。，灭菌 20min.[0081]平板富集培养基:橄榄油3.0，蛋白胨5.0，NaCl 3.0g/L, NH4Cl 0.lg/L,MgSO40.02g/L, NaNO30.2g/L, KH2PO40.lg/L, K2HPO40.2g/L，琼脂 20g/L，pH 7.0，于 121 °C，灭菌 20min.[0082]LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L.[0083]种子培养基:葡萄糖5g/L,蛋白胨10g/L,磷酸二氢钾lg/L,七水硫酸镁0.5g/L。
[0084]发酵培养基:葡萄糖5g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾2g/L，橄榄油20g/L。pH为
8.0。
[0085]在本发明的下述实施例中，
[0086]排油活性检测方法如下:取一直径9cm的培养皿，加30ml蒸馏水，在水面上滴入0.2ml经苏丹红染色的液体石蜡，以形成油膜，在油膜中央滴加0.2ml待检测溶液，然后观察是否产生排油圈，如 未产生排油圈，则表明无排油活性，反之，则测量排油圈直径，以确定排油活性强弱。
[0087]临界胶束浓度(CMC)检测方法如下:
[0088]检测不同浓度下的表面活性剂的表面张力，并基于表面活性剂的浓度和相应的表面张力作图，获得不同浓度下的表面活性剂的表面张力曲线，该曲线的表面张力突然开始上升的转折点的浓度即为该表面活性剂的CMC。
[0089]实施例1.菌株筛诜与鉴定
[0090]本发明所提供的菌株假单胞菌Pseudomonas.sp.D4分离自中国新疆维吾尔自治区吐鲁番市东南艾丁湖中间土壤中。将新采集的土壤样品加入至无菌生理盐水中，220r/min摇床震荡2h，静止30min后取上清液IOml接种装有50ml富集培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180rpm/min,震荡培养3d，收获培养液。
[0091]将收获的培养液分别用无菌生理盐水稀释105，IO6, IO7倍，每个稀释度取0.1ml菌液涂布于平板富集培养基，于30°C静止培养4d。将平板富集培养基上有嗜油斑的菌落，进一步在LB培养基平板上划线分离纯化，并挑取单菌落保藏在斜面保藏培养基(LB培养基)上。
[0092]将培养48小时的斜面菌株接种到装有50ml种子培养基的250ml挡板摇瓶中，于28°C、200rpm/min震荡培养16小时，得到种子培养液。按照2% (v/v)的接种量接种于装有50ml发酵培养基的250ml挡板摇瓶中，于28°C、200rpm震荡培养72h，通过测定发酵液的排油活性筛选出产表面活性剂能力强的菌株，命名为D4。
[0093]参考A.Unver.，H.M.Erdogan.，H.1.Atabay.，M.Sahin and 0.Celeb1.1solation, identification, and molecular characterization of Brucella melitensisfrom abortedsheep fetuses in Kars, Turkey.Revue Med.Vet.，2006，157，1，42-46.的方法，提取该菌的16S rRNA，并测序，结果显示，其rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。将所测序列在RDP数据库对比分析，构建系统进化树。结果表明菌株D4属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas.sp.D4。
[0094]该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。该保藏单位的地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编是100101。该菌株的保藏日期是2012年11月22日，保藏号是CGMCC N0.6780。
[0095]菌株形态特征:
[0096]该菌株在LB培养基上28 °C培养72小时，菌落白色、圆形、隆起、不透明、表面光滑、湿润。
[0097]实施例2.菌株培养
[0098]2.1种子培养
[0099]从培养成熟的斜面培养基上挑下一环D4菌株，接种于装有50ml种子培养基的250ml挡板摇瓶中，于28°C、200rpm/min震荡培养16小时，得到种子培养液。
[0100]2.2发酵培养
[0101]将步骤2.1制备得到的种子培养液按照2% (V/V)的接种量接入装有50ml发酵培养基的250ml挡板摇瓶中，于28°C、200rpm震荡培养72小时，得到D4菌株发酵液。
[0102]2.3发酵液检测
[0103]将步骤2.2制备获得的发酵液用蒸馏水稀释4倍后，于8000r/min、4°C，离心20min,分别收集发酵上清和菌体沉淀。将沉淀的菌体使用蒸馏水制备成菌悬液，分别检测离心上清液和菌悬液的排油圈大小，以检测排油活性。
`[0104]结果显示，在加入上清液的培养皿中产生了排油圈，而加入菌悬液的培养皿不产生排油圈。根据该结果，菌株D4产生的具有排油活性的产物主要分布在胞外，为胞外离子型生物表面活性剂。
[0105]实施例3.生物表面活性剂制备及处理
[0106]3.1生物表面活性剂制备
[0107]取步骤2.2制备获得的发酵液120ml，用蒸馏水稀释4倍后，于8000r/min，4°C离心20min，去除菌体，并将收集的上清液用浓盐酸调pH至2.0，出现絮状沉淀，4°C静止过夜。10000r/min，4°C离心30min，收集沉淀，并使用pH 2.0的盐酸洗涤一次，随后将该沉淀用lmol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，冷冻干燥，获得浅褐色疏松状固体的表面活性剂粗品^2.57g，其得率为 2L4g/L。
[0108]用原始发酵液4倍体积的氯仿和甲醇(体积比为2:1)萃取粗品FJ次，将所得的有机相合并，于60°C烘干，获得提纯样品F20.548g，其得率为4.57g/L。
[0109]3.2样品水解
[0110]取步骤3.1中制备的F2样品0.5g，置于螺旋水解管中，加入12ml 6mol/L盐酸，加入3-5滴酚酞，振摇使样品均匀分散于溶液中，将水解管置于_20°C冰箱中冷冻8小时后用氮气吹5min，然后于110°C烘箱水解24小时，取出冷却后，将水解液全部转移到25ml容量瓶中,用去离子水定容至刻度,混匀,备用。
[0111]实施例4、假单胞菌Pseudomonas.sp.D4产脂肽类生物表面活性剂的类型分析
[0112]4.1产物带电性能检测
[0113]参考 HUA TL.Basic characteristics of biosurfactants produced withCandidaAntarctica.Detergent and Cosmetics, 2000, 23(1):78-80.的方法，对实施例 3 中制备获得的发酵产物F2的带电性进行检测，具体如下:
[0114]阴离子生物表面活性剂检测方法(亚甲基蓝-氯仿测定法):取5ml样品，加IOml亚甲基蓝溶液和5ml氯仿，用力震荡数分钟，如果氯仿层变蓝色则表明杨平为阴离子生物表面活性剂。
[0115]阳离子生物表面活性剂检测方法(溴酚蓝测定法):向5ml样品中滴加2-5滴溴酚蓝溶液，若混合液变成深蓝色，则证明是阳离子生物表面活性剂。
[0116]结果显示，阴离子性检测发现氯仿层变蓝，而阳离子检测样品-溴酚蓝混合物未变深蓝，说明产物为阴离子生物表面活性剂。
[0117]4.2还原糖检测
[0118]分别检测样品F2水解前后的还原糖变化，具体过程如下:
[0119]1、依次加入1ml样品+A液10ml+B液10ml+29ml蒸馏水；
[0120]2、煮沸，沸腾2min后取出冷却；
[0121]3、加入 C 液 10ml+D 液 10ml，摇匀；
[0122]4、用E液滴定，至溶液呈淡黄色，加入1-2滴可溶性淀粉(F液)；
[0123]5、继续用E液滴定，至`蓝黑色消失，记录E液消耗体积Vs。
[0124]计算方法:还原糖％ (DE) =(Vo-Vs)/ (Vo-V 标)X 2%
[0125]VO:空白样消耗滴定液体积Vs:样品消耗滴定液体积
[0126]V标:2%葡萄糖标准溶液消耗滴定液体积
[0127]试剂配制方法:
[0128]A, CuS04.5H20 692g — IOL ；
[0129]B, KNaC4H406.4H20 3460g+Na0H 1032g — IOL ；
[0130]C, KI 3000g— 10L;
[0131]D, H2S04 1420ml — IOL ；
[0132]E，0.1M Na2S203.5H20 252g+Na2C03 IOg — IOL ；
[0133]F，2%淀粉液(指示剂)。
[0134]结果显示，样品F2水解前后的还原糖含量均为零，因此，该产物不属于糖脂类生物表面活性剂。
[0135]4.3硅胶薄层层析检测
[0136]参考王健等，生物表面活性剂产生菌的筛选及特性研究.大连工业大学学报，2011年I月第30卷第I期，p34-38.的方法，对发酵提取产物F2进行硅胶薄层层析(TLC)试验，其中:
[0137]取0.05g F2样品溶于100mL氯仿:甲醇(体积比为2:1)混合物中，以氯仿、甲醇、水(体积比为65:15:2)为展开剂展开样品，然后分别喷洒显色剂苯酚-硫酸试剂和茚三酮试剂，其中，苯酚硫酸显色剂配方如下:3g苯酚和5ml浓硫酸溶于95ml无水乙醇；茚三酮显色液配方如下:0.7% (w/v)却三酮乙醇溶液；薄层层析用硅胶板为德国Merck公司产品silica gel 60F254。
[0138]当以苯酚-硫酸试剂为显色剂，且显棕色斑点时，表明该表面活性剂为糖脂；当以茚三酮试剂为显色剂，且显红色斑点时，表明该表面活性剂为脂肽[0139]结果显示:喷洒苯酚硫酸显色剂后不显色，而喷洒茚三酮显色液，90°C烘5min后显紫红色斑点。根据该结果，产物与茚三酮直接反应呈紫红色，说明该产物含有游离的氨基酸，初步说明该产物为线性或非环状脂肽类表面活性剂。
[0140]4.4氨基酸组成分析:
[0141]采用HPLC仪器分析步骤3.2中制备获得的水解样品液F2中的氨基酸组成，采用Agilent 1100 四兀梯度泵系统，色谱柱:Venusil-AA HPLC Column (5 μ mX4.6mmX 250mm),流速:1.0ml/min,柱温:40 C，进样量:20 μ L。结果如图1所不，并根据氣基酸标准品确定各峰成分，基于峰面积计算确定各组分的百分含量，从而统计出F2中氨基酸组成，结果如表1所示。
[0142]表1、F2氨基酸组成
【权利要求】
1.一种假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌的保藏号为CGMCC N0.6780。
2.如权利要求1所述的假单胞菌的发酵液。
3.权利要求2所述的发酵液，其特征在于，在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养权利要求1所述的假单胞菌，以获得所述发酵液； 优选的，所述发酵液为发酵上清。
4.一种制备权利要求2或3所述的发酵液的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养权利要求1所述的假单胞菌，以获得所述发酵液； 优选的，所述方法还包括收集发酵上清的步骤。
5.—种生物表面活性剂，其特征在于，所述生物表面活性剂由权利要求1所述的假单胞菌产生。
6.—种生物表面活性剂，其特征在于，所述表面活性剂为脂肽类表面活性剂，所述表面活性剂的氨基酸组成如下: 0.67%天冬氨酸，6.25%甘氨酸，0.76%酪氨酸，1.41%半胱氨酸，5.43%苯丙氨酸，0.89%丝氨酸，45.46%脯氨酸，13.52%亮氨酸，3.82%丙氨酸，6.63%缬氨酸，12.34%异亮氨酸，1.1%赖氨酸，1.7%甲硫氨酸； 所述表面活性剂的CMC为30mg/L ；` 所述表面活性剂为线性结构。
7.一种制备权利要求5或6所述的生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 在适宜产生生物表面活性剂的条件下培养权利要求1所述的假单胞菌，收集发酵上清，以获得所述生物表面活性剂； 优选的，所述方法还包括纯化所述发酵上清的步骤；优选的，所述纯化包括以下步骤: 1)调节所述发酵上清液的PH至1.8-2.5，收集沉淀； 2)将步骤I)收集的沉淀干燥，获得所述表面活性剂；优选的，在干燥所述沉淀前，将沉淀的pH调节至6-8 ； 更优选的，在所述纯化步骤后还包括使用有机溶液洗涤所述表面活性剂的步骤；优选的，所述有机溶液包括:二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸乙酯中的一种或多种；更优选，所述有机溶液为氯仿和甲醇中的一种或多种。
8.权利要求1所述的假单胞菌用于制备生物表面活性剂的用途。
9.权利要求2或3所述的发酵液作为生物表面活性剂的用途；优选的，所述发酵液为发酵上清。
10.权利要求1所述的假单胞菌、权利要求2或3所述的发酵液或权利要求5所述的生物表面活性剂用于采油工业、环境生物修复领域和/或食品工业的用途。
【文档编号】C12R1/38GK103865819SQ201210525880
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2012年12月7日
【发明者】关惠琴, 顾思天, 高霓思, 石兴利, 包悦佚, 常桂芳 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司