一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用。该产细菌漆酶的恶臭假单胞菌(Pseudomonas?putida?zk1)保藏编号为CCTCC?NO：M2013280。恶臭假单胞菌用于制备细菌漆酶时，将恶臭假单胞菌接种倒富含铜离子的LB培养基中，在35‐39摄氏度之间培养48‐96h后，在离心机上离心处理，弃上清液收集菌体，用水将菌体重新悬浮，用细胞破碎仪破碎细胞，再次离心处理，收集上清液，得细菌漆酶。该细菌漆酶可应用于印染废水处理或客家酿酒澄清处理。本发明恶臭假单胞菌分离自农业堆肥，能产生大量细菌漆酶，其漆酶最适作用pH为碱性、能氧化多种酚类和非酚类底物，应用价值大。
【专利说明】一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种漆酶,特别是涉及一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，该恶臭假单胞菌是从自然界中筛选、分离、纯化得到，能氧化多种酚类及人工染料的漆酶；本发明属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]漆酶(EC.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，以氧为电子受体，氧化包括酚类，多酚类，苯胺、木质素，多环芳香烃等一系列化学结构稳定的化学物质，在反应过程中生成的唯一副产物就是水。
[0003]第一种漆酶是由日本人Yoshida在1883年在植物漆树(Rhus vernicifera)树脂中发现，随后在多种植物和多种真菌检测到漆酶的活性。到2008年学者统计已经超过了上百中真菌漆酶并被分离提纯，并且这个数字还在快速的增加。但直到1993年，Givaudan才首次在水稻根围中分离得到一株产漆酶的脂固氮螺菌，这是第一次在原核生物检测到漆酶活性。2000年，Alexandre通过生物信息学分析技术,证实漆酶也普遍存在于原核生物中。迄今为止已经在多种原核微生物中如Marinomonas mediterranea、链霉菌、枯草芽孢杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌中检测到漆酶活性。细菌漆酶与真菌漆酶在氨基酸序列上具有较大差异，因此也被定义为类漆酶。研究表明细菌漆酶与真菌漆酶往往具有稳定性好、PH作用范围广泛，不含糖基，易于异源表达等优点。但是关于细菌漆酶的研究报道还是非常少。
[0004]漆酶具有多种优点。漆酶氧化底物特异性不强，可以氧化包括酚类和非酚类多种底物，据不完全统计，其可以氧化底物超过了 250种；漆酶与其他过氧化物酶比较，无需额外添加如H2O2辅助因子，对环境友好；漆酶在添加化学介质的条件下，可以将氧化还原电位高于漆酶的化学物质，或者无法接触到漆酶催化中心的大分子物质有效氧化。
[0005]漆酶的优点使得漆酶在印染废水处理、多酚废水的处理、木质素的降解与生物能源、纸浆漂白、有机物合成、果汁澄清、生物传感、生物检测等多个方面具有重要的应用潜力aPeralta利用云芝漆酶在酸性条件下对多种染料进行脱色(Peralta-Zamora P, PereiraC M, Tiburtius E R L, et al.Decolorization of reactive dyes by immobilizedlaccase [J].Applied Catalysis B:Environmental, 2003, 42 (2): 131-144),研究表明云芝漆酶在固定化或者添加化学介导物的情况对靛蓝、偶氮染料活性黑G、孔雀石绿等染料具有良好的脱色效果。
[0006]Galliano等对木硬孔菌(Rigidoporus Iignosus)产生的漆酶和猛过氧化物酶进行了体外研究，证实二者协同作用降解木质素；Ibarra-Escutia等将白腐菌产生的漆酶成功地固定到丝网印刷石墨电极上设计出安培生物传感器，能够准确、灵敏、快速地检测茶中酚化合物的含量；Ikeda等在不添加甲醛等有毒助剂的水溶液中，利用漆酶催丙烯酰胺聚合形成高分子量的化合物。因而，寻找能够新的能够产漆酶的细菌菌株微生物就显得非常有意义。
[0007]但现在普遍使用的漆酶均为真菌漆酶，适合作用的环境为酸性环境，对某些结构稳定染料的脱色需要额外添加化学介导物，限制了使用范围，增加应用成本。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌及应用，利用从自然环境中分离筛选出一株新的能够产细菌漆酶的菌株，产生的细菌类漆酶适于PH为碱性，对靛蓝等染料可以直接脱色，无需添加化学介导物，为细菌漆酶的生产制备提供一种新的可利用的微生物，为人工染料降解、酚类废水处理、木质素降解、生物传感等领域提供新的技术手段。
[0009]本发明目的通过如下技术方案实现:
[0010]一株产新型产漆酶的恶臭假单胞菌，建议的分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl);本发明提供的菌株从农村堆肥中分离得到，能够产生一种新型作用PH范围，可以直接氧化多种顽固类染料的细菌漆酶，经微生物学鉴定和基因学归属后证实属恶臭假单胞菌,保存于中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，简称CCTCC M2013280，湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码430072，电话027-68752319)，保藏日为2013年6月23日。
[0011]该恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)为革兰阴性菌,短杆状,有鞭毛,该菌菌株的菌落为中等大小、圆形，规则，高突起，边缘呈叶状，白色、不产生黑色素等。
[0012]所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)用于制备细菌漆酶的应用，将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)接种倒富含铜离子的LB培养基中，在35_39摄氏度之间培养48-96h后，在离心机上离心处理，弃上清液收集菌体，用水将菌体重新悬浮，用细胞破碎仪破碎细 [0013]优选地,所述在离心机上离心处理的转速为6000r/min,时间10min-20min。所述再次离心处理的转速为13000r/min ;时间为15_min25min。
[0014]一种细菌漆酶，由应用所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)制得。
[0015]所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)在添加铜离子的LB培养基中，可以产生大量的细菌漆酶，产生的细菌漆酶为胞内酶。该漆酶是一种碱性漆酶，最适作用PH在7-10之间，且在碱性条件下具有较好的稳定性，能够氧化愈创木酚、α -萘酚、靛蓝、孔雀石绿、刚果红、橙黄I等多种底物，不同于己经报道的其他漆酶酶。该细菌漆酶可应用于印染废水处理或客家酿酒澄清处理。
[0016]相对于现有技术，本发明的优点在于，本发明恶臭假单胞菌分离自农业堆肥，能产生大量细菌漆酶，其漆酶最适作用PH为碱性、能氧化多种酚类和非酚类底物，该菌株应用价值大。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为菌株zkl漆酶活性的pH值曲线图。
[0018]图2为zkl漆酶对客家酿酒稳定性的影响效果图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是，实施例并非对本发明保护范围构成限制。[0020]实施例1:zkl菌株的分离、筛选及鉴定
[0021]一、zkl菌株的分离
[0022]从广州市白云区沙龙新朗头村农村堆肥取样。添加到含有CuS04质量浓度为0.05%的LB液体培养基中，在37°C培养箱进行富集培养48小时，利用无菌水进行梯度稀释，然后用固体LB液体培养基进行稀释平板法分离单个菌落，利用含有1%质量愈创木酚的乙醇溶液和1%质量的α -萘酚的乙醇溶液进行显色反应，挑选呈现粉红色或灰黑色菌落进行反复划线筛选获取纯菌落，接种于斜面培养基并进行摇瓶发酵复筛。所得Zkl菌株的菌落为中等大小、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型菌落，培养24h为白色，不产色素。
[0023]二、Zkl菌株的形态特征
[0024]取37°C恒温培养箱中培养zkl菌24h后，进行革兰染色和透射电子显微镜下进行观察，结果发现菌株zkl为革兰阴性菌,短杆状,大小约为0.5~1.0 μ mX2~4 μ m,有鞭毛。
[0025]三、zkl菌株的生理生化特征
[0026]将zkl菌种接种的LB培养基培养24h后，利用VITEK全自动细菌鉴定仪，采用革兰氏阴性鉴定卡，7h后读取鉴定结果，zkl菌种生化结果如表1所示。
[0027]表1Zhl的生化鉴定结果
[0028]
【权利要求】
1.一种产细菌漆酶的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl),其特征在于:其保藏编号为 CCTCC NO:M2013280o
2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida zkl)用于制备细菌漆酶的应用，其特征在于，将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)接种倒富含铜离子的LB培养基中，在35 - 39摄氏度之间培养48 - 96h后，在离心机上离心处理，弃上清液收集菌体，用水将菌体重新悬浮，用细胞破碎仪破碎细胞，再次离心处理，收集上清液，得细菌漆酶。
3.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida zkl)用于制备细菌漆酶的应用，其特征在于，所述在离心机上离心处理的转速为6000r/min,时间IOmin -20min。
4.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida zkl)用于制备细菌漆酶的应用，其特征在于，所述再次离心处理的转速为13000r/min ;时间为15 - min25min。
5.一种细菌漆酶，其特征在于，其由应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida zkl)制得。
6.权利要求5所述的细菌漆酶在印染废水处理或客家酿酒澄清处理中的应用。
【文档编号】C12R1/40GK103789237SQ201410036635
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】刘锐, 白卫东, 刘岩, 赵文红, 冯柏源 申请人:仲恺农业工程学院