具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
【专利摘要】本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码PRE样（多效唑抗性）多肽、SCE1（SUMO缀合酶1）、YEF1（产量增强因子1）、亚组III谷氧还蛋白（Grx）、或FT姐妹蛋白或其同源物的核酸的表达来改进多种植物生长特征或增强多种产量相关性状或改变植物根茎比的方法。本发明还涉及具有调节的核酸表达的植物，所述核酸编码所述多肽，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物而言具有改进的生长特征或具有增强的产量性状或具有改变的根茎比。本发明还提供了用于本发明方法中的构建体。本发明还提供了此前未知的SCE1-编码核酸，可用于进行本发明的方法。
【专利说明】具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
[0001]本申请为2009年I月23日提交的、发明名称为“具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法”的PCT申请PCT/EP2009/050735的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年9月9日，申请号为200980108341.8。
[0002]本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码PRE样(多效唑抗性,Paclobutrazol REsistance)多肽的核酸的表达来改进多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有调节的核酸表达的植物，所述核酸编码PRE样多肽，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物而言具有改进的生长特征。本发明还提供了用于本发明方法中的构建体。[0003]在另一实施方案中，本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码SCE 1(SUM0缀合酶IJUMO Conjugating Enzymel)的核酸的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节的核酸表达的植物，所述核酸编码SCEl，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供了此前未知的SCEl-编码核酸以及包含其的构建体，它们可用于进行本发明的方法。
[0004]在又一实施方案中，本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码YEF1(产量增强因子1，Yield Enhancing Factorl)的核酸的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节的核酸表达的植物，所述核酸编码YEFl，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供了用于本发明方法中的构建体。
[0005]在又一实施方案中，本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码亚组III谷氧还蛋白(Grx)的核酸的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节的核酸表达的植物，所述核酸编码亚组III Grx，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供了用于本发明方法中的构建体。
[0006]在还一实施方案中，本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码FT姐妹蛋白(Sister ofFT protein)或其同源物的核酸的表达来改变植物根茎比的方法。本发明还涉及具有调节的核酸表达的植物，所述核酸编码FT姐妹蛋白或其同源物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物而言具有改变的根茎比(ration ofroots to shoots)。本发明还提供了用于本发明方法中的构建体。
[0007]持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。但是，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0008]具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
[0009]种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新枝条和新根的起源)和胚乳(萌发期间及籽苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
[0010]对于许多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的枝条与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出幼苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区引种玉米(Zea mayes L.)杂种。
[0011]又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等、Planta(2003) 218:1_14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
[0012]作物产量因而可以通过·优化前述因素之一而提高。
[0013]取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对提高种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。
[0014]特别有农业兴趣的另一'丨生状是改变的根:莖比(root:shoot ratio,根:枝条比)。具有减少的地上植物区域并且保持足够的根生物量的植物特别适合在暴露的地区种植。这将允许在不利条件期间和原本不能种植作物的地域中种植作物。现已发现，可通过调节植物中编码FT姐妹蛋白或其同源物的核酸的表达来改进植物根:茎比。
[0015]提高植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。
[0016]现在发现可以通过调节下述核酸在植物中的表达来在植物中改进多种生长特征，所述核酸编码PRE样(多效唑抗性)多肽。
[0017]在另一实施方案中，现在发现可以通过调节下述核酸在植物中的表达来在植物中改进多种产量相关性状，所述核酸编码SCEl (SUM0缀合酶I)或YEFl (产量增强因子I)，或者编码亚组III谷氧还蛋白或Grx。
[0018]背景
[0019]PRE 样(多效唑抗性，Paclobutrazol REsistance)
[0020]赤霉素是被子植物、裸子植物、蕨类植物，可能还是苔藓类和藻类以及至少一些真菌中的一组结构相关化合物。它们干扰植物生长和发育的不同方面，包括萌发、茎延长、叶扩展、开花和果实发育(Holey, Plant Mol.Biol.26，1529-1555，1994)。近来，PRE1(HLH 转录调控子)显示出参与赤霉素信号传导(Lee等人，Plant Cell Physiol.47，591-600)。其由赤霉素诱导，并且处于GAI和SPY(赤霉素信号传导的上游负调控子)的控制下。PREl并非bHLH转录因子，因为其缺乏HLH结构域前的碱性结构域。其具有核定位。PREl在拟南芥属中的过量表达或活化标签化(activation-tagging)导致更短的生命周期以及更早的开花(这两者都在短和长日条件下)。据报道，PREl对萌发频率没有影响，但是过量表达PREl的幼苗具有增加的胚轴长度。没有观察到对初级花序的影响。
[0021]PREl属于小的基因家族，Lee等人(2006)报道了拟南芥属中的6个成员，它们在序列和长度上全部都很相似。在转基因植物中的过量表达产生了相似的作用，这暗示PRE基因可能是功能上多余的(Lee等人，2006)。PRE样多肽显示出与Id蛋白极少的序列同源性。这些蛋白大约120-150个氨基酸长，并且还具有HLH结构域但是没有碱性结构域。Id蛋白与普遍存在的bHLH蛋白E结合，由此阻止E蛋白与其它bHLH结合(它们进而不再与其靶启动子结合，由此失活bHLH靶基因的表达)。Id蛋白在正常细胞中低水平表达，但是它们在很多肿瘤类型中具有作用(细胞周期进展、肿瘤侵入、肿瘤血管形成)。
[0022]W02005/072100描述了对来自拟南芥属的PRE样多肽的鉴定，当其在拟南芥属中过量表达时，导致种子油含量增加。没有报道过其它表型作用。
[0023]SCEl (SUM0 缀合酶 I, SUMO Conjugating Enzymel) [0024]真核蛋白功能部分受翻译后过程(例如小多肽的共价结合)调控。最频繁且最佳的特征在于通过泛素和泛素样蛋白的修饰。SUM0,小泛素样修饰子(small ubiquitin-likemodifier)与泛素在三级结构上相似，但是一级序列不同。SUMO与靶蛋白缀合的过程被称为sumo化(sumoylation),其中涉及大量酶的顺序作用，即，活化(El)、缀合(E2或SUMOE2)和连接酶(E3)。该过程是可逆的，去sumo化是从底物除去SUM0，其由SUMO蛋白酶介导。机制上，sumo化包含不同的阶段。最初，El酶复合体通过经由高反应活性的巯基键与SUMO结合来活化其。然后经活化的SUMO经由trans-sterification反应转移至E2缀合酶,这涉及E2酶中的保守半胱氨酸残基。残基半胱氨酸94是拟南芥E2酶(也被称为AtSCEl蛋白)中的缀合残基。在最后步骤中，SUMO通过异肽键转移至底物。
[0025]虽然泛素的蛋白修饰通常导致蛋白降解，sumo化，即，SUMO与蛋白的缀合通常与蛋白稳定化相关。Sumo化功能在酵母和动物中被最好地理解，其中，其在信号转导、细胞周期DNA修复、转录调控、核输入和随后的定位以及病毒致病原因中具有作用。植物中，sumo化与应答于发育、激素和环境改变的基因表达的调控相关(Miura等人2007.CurrentOpinion in Plant Biol.10，495-502)。
[0026]Sumo化途径的蛋白组分被编码于真核细胞的基因组中。在酵母和哺乳动物中，描述了单个的SUMO E2缀合酶。虽然最初在拟南芥中仅发现了单个SUMO E2，AtSCEla(Lois等人2003.The Plant Celll5，1347-1359)，但一些植物可具有多种同种型，例如对水稻来说，已经描述了编码E2酶的三个基因(Miura等人2007)。AtSCEla蛋白的特征在于UBC结构域以及活性位点半胱氨酸残基的存在。在拟南芥中，有超过40种含UBC结构域蛋白，其中绝大多数被认为作为泛素缀合酶发挥作用，它们中仅有四种预计或显示出对泛素样蛋白的缀合有功能。后者中，仅被认为是假基因编码的AtSCEla(At3g57870)和截短的SCElb蛋白(At5g02240)被提出作为SUMO E2缀合酶发挥作用(Kraft等人Plant Phys2005,1597-1611)。较之其它UBC蛋白，SCEla蛋白具有更高的与人UBC12和UBC9的氨基酸同一性。进化系统分析揭示，具有UBC结构域和活性位点半胱氨酸氨基酸残基的拟南芥蛋白可被分进16组，其中组I在SUMO缀合途径中发挥功能(Kraft等人2005)。
[0027]对烟草属(Nicotiana)SCEl蛋白的功能性表征显示,其可体外活化SUM0,并且其可补足酵母SUMO E2突变体(Castilo等人2004.J.virology78:2758-2769)。过量表达被组氨酸标签修饰的AtSCEla的拟南芥转基因植物用于显示AtSCEla和SUM01/2的核共定位(Lois等人2003)。作者显示，转基因植物以改变的行为应答于特定的胁迫，例如盐和激素ABA，但是不针对激素生长素(auxin)。然而，作者没有指出在缺乏导致胁迫的因子的对照培养基上生长的转基因植物和对照之间的任何生长区别。
[0028]YEFl (产量?曾弓黾因子 I, Yield Enhancing Factorl)
[0029]蛋白和RNA之间的相互作用是植物发育和功能的很多方面的基础。因此，植物和其它真核生物编码数百种含有与核酸(例如RNA (核糖核酸)和DNA (脱氧核糖核酸))相互作用的结构域的蛋白。蛋白中存在的与核酸相互作用的蛋白结构域的例子是CCCH锌指(C3H Znf)结构域和RRM(RNA识别基序)结构域。
[0030]CCCH结构域已在参与细胞周期或生长阶段相关调控的蛋白中被发现，例如在人TISllB(丁酸酯应答因子I)和人剪接因子U2AF35kD亚基中被发现，其通过介导必要的蛋白-蛋白相互作用和蛋白-RNA相互作用(3，剪接位点选择所需的)在组成型和增强子依赖型剪接中都具有关键作用。锌结合结构域是稳定的结构，其与其靶结合时很少经历构象改变。已提出，蛋 白中的锌指结构域是稳定的骨架，它们进化了专门功能。例如，Znf结构域在基因转录、翻译、mRNA运输(trafficking)、细胞骨架组织、上皮发育、细胞粘附、蛋白折叠、染色质重构和锌感知中发挥功能。已经显示，不同的CCCH型的Znf蛋白与多种mRNA的3’ -非翻译区域相互作用(Carballo等人1998Science2811001_1005)。CCCH结构域可通过序列C-X8-C-X5-C-X3-H来表示，其中保守半胱氨酸和组氨酸残基被提出与Zn离子配位(Brown2005.Curr.0pin.Struct.Biol.1594-8)。
[0031 ] RNA识别基序或RRM —般存在于参与转录后事件的大量不同的RNA结合蛋白中，其中，每个蛋白的RRMs的数量在从一至数拷贝之间变化。RRM是大约80个氨基酸的区域，其含有若干个良好保守的残基，其中一些聚类为两个短的亚基序，RNP-1 (八聚体)和RNP-2(六聚体)(Birney 等人，Nucleic Acids Research, 1993, Vol.21, N0.25,5803-5816)。含有 RRM结构域的蛋白的例子包括异源核糖核蛋白(hnRNPs)、与对替代性剪接的调控相关的蛋白(SR.U2AF.Sxl)、小核核糖核蛋白的蛋白组分(Ul和U2snRNPs)以及调控RNA稳定性和翻译的蛋白(PABP，La，Hu)5REF)。基序还出现于一些单链DNA结合蛋白中。典型的RRM结构域由四条反平行的β链和两条α-螺旋以β-α-β-β-α-β折叠排列成,其中侧链与RNA碱基堆叠。RNA结合的特异性是通过与周围氨基酸的多种接触来测定的。一些情况下，在RNA结合期间存在第三螺旋(Birney Ε.等人1993 ；Maris C.等人2005FEBS J2722118-31)。[0032]若干数据库具有包含RRM结构域的蛋白的目录，例如植物RBP(Walker，等人2007.Nucleic Acids Res,35, D852-D856) ;pfam(Bateman 等人 2002.Nucleic AcidsResearch30 (I):276-280)和 InterPro (Mulder 等人，(2003) Nucl.Acids.Res.31,315-318)。RRM 结构域和 CCCH 在 InterPro 中的登录号分别是 IPR000504、IPR000571。
[0033]对蛋白和蛋白结构域数据库(例如IntrePro和pfam)的挖掘揭示,仅少量真核蛋白除了包含CCCH和RRM结构域之外，还包含通常在N-末端发现的、模拟组蛋白折叠结构域的较为保守的结构域(InterPro登录号IPR0009072)。此类蛋白的一个例子是Le_YEFl_l，这是下文描述的番茄蛋白。组蛋白折叠结构域由三个螺旋的核心构成，其中，长的中间螺旋每个末端侧翼有较短的螺旋。展示出该结构的蛋白包括核小体核心组蛋白和TATA-框结合蛋白(TBP)相关因子(TAF)，其中，组蛋白折叠是介导TAF-TAF相互作用的常见基序。TAF蛋白是转录因子IID的组分(TFIID)。TFIID形成了 RNA聚合酶II依赖型转录所需的核心启动子元件上启动前复合体的部分。
[0034]亚组III谷氧还蛋白(Grx)
[0035]活细胞在其正常环境中经历的氧化还原化学由氧支配。但是活细胞的胞质溶胶是非常还原性的环境，还原性条件对其正确的功能来说是必需的。氧和分子氧的反应性衍生物是对生物系统的持续威胁。普通蛋白的唯一显著的氧化还原活性组分是氨基酸半胱氨酸，其在正常大气条件下将完全氧化，形成二硫键。虽然二硫化物交联对很多分泌性蛋白的结构和稳定性都很重要，但是它们在胞质溶胶蛋白中基本上不存在。如果它们通过分子氧或活性氧产生自自发氧化，活细胞具有两种主要途径来处理二硫键在胞质溶胶中的还原:硫氧还蛋白和谷氧还蛋白途径。关键成分是下述结构相似的小的酶(硫氧还蛋白和谷氧还蛋白(Grx)),所述小的酶利用CysXaaXaaCys序列基序(其中Xaa可以是大量不同的氨基酸残基)中的反应性硫醇-二硫化物中继系统(relay system)。谷氧还蛋白(Grx)催化蛋白中二硫键还原，将谷胱甘肽(GSH)转化为谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。GSSG进而通过谷胱甘肽还原酶循环成GSH，其间消耗NADPH。在反应循环中，人们认为谷氧还蛋白活性位点处的半胱氨酸对被转化为二硫化物。
[0036]当植物处于不利环境条件(生物性或非生物性胁迫)下时，它们非常经常通过产生氧化裂解来反应。为避免生物损害，氧化种类的浓度应当受到控制。谷氧还蛋白(Grxs)在植物中最常被记载的功能之一是其参与氧化胁迫应答。它们与很多不同途径相关，例如，通过直接还原过氧化物或者脱氢抗坏血酸酯(DHA)，通过还原过氧化物氧还蛋白(peroxiredoxins,Prx)以及还通过保护其它酶上的硫醇基团(经由谷胱甘肽化/去谷胱甘肽化机制)Arxs需要被还原以发挥功能，还原系统由被称为谷胱甘肽还原酶(GR)的NADPH依赖性吡啶核苷酸氧化还原酶和小的三肽-谷胱甘肽构成。Rouhier等人,2006, Journalof Experimental Botany, 5 月 23 日。 [0037]Grx多肽已基于序列比对、活性位点序列以及无根进化系统树被分为三个亚组(见 Rouhier 等人,2006)。
[0038]Rouhier等人，2006报道称，亚组I含有具有CPYC、CGYC, CPFC和CSY[C/S]活性位点的Grx。该组包含五种不同的Grx (Grx C1-C4和S12),它们的活性位点序列有所不同。使用的命名法(C或S)基于在活性位点的第四个位置上存在半胱氨酸或丝氨酸(CxxC或CxxS)。他们报道，亚组II的蛋白具有CGFS活性位点，但是它们重复模块的数量不同。亚组III的蛋白被报道为主要具有CC[M/L] [C/S]形式的活性位点。
[0039]FT 姐姝
[0040]FLOWERING LO⑶S(FT)基因在整合拟南芥中的开花信号中具有中枢作用，因为其表达受光周期和春化作用途径的拮抗性调控。FT属于特征在于磷酯酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域的六个基因的家族。在拟南芥中，FT编码与磷酯酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)相似的蛋白。FT是小基因家族的成员，该家族包括5个其它基因:TERMINAL FLOWER I (TFLl)、TWIN SISTER OF FT (TSF)、ARABIDOPSIS THALIANA CENTRORADIALIS(ATC)、BROTHER OF FTAND TFLl 和 MOTHER OF FT AND TFLl (MFT)。BFT 与开花无关，但是 FT、TSF 以及 MFT (程度较低)的组成型表达加速开花。Faure等人，2007，Geneticsl76:599_609。
【发明内容】
[0041]令人惊讶地，现已发现调节下述核酸的表达提供了相对于对照植物具有增强的产量相关性状(特别是相对对照植物而言，增加的种子产量)的植物，所述核酸编码PRE样多肽，条件是增加的种子产量不包括增加的种子油含量。
[0042]根据一个实施方案，提供了相对于对照植物改进植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码PRE样多肽的核酸的表达。改进的产量相关性状包括提高的种
子产量。
[0043]还令人惊讶地，现已发现调节下述核酸的表达提供了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，所述核酸编码SCEl多肽。
[0044]根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码SCEl·多肽的核酸的表达。增强的产量相关性状包括提高的枝条(shoot)和根生物量以及增加的数量的圆锥花序和植物种子。
[0045]此外，令人惊讶地，现已发现调节下述核酸的表达提供了相对于对照植物具有增强的产量相关性状(特别是相对对照植物而言，增加的产量)的植物，所述核酸编码YEFl多肽。
[0046]根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中调节编码YEFl多肽的核酸的表达，以及任选地，选择具有增强的产量相关性状的植物。
[0047]此外，令人惊讶地，现已发现调节下述核酸的表达提供了相对于对照植物具有增强的产量相关性状(特别是(增加的产量))的植物，所述核酸编码亚组III Grx多肽。
[0048]此外，令人惊讶地，现已发现调节下述核酸的表达提供了相对于对照植物具有改变的根:茎比的植物，所述核酸编码FT姐妹蛋白或其同源物。
[0049]根据一个实施方案，提供了改变植物的根:茎比的方法，所述方法包括在植物中调节编码FT姐妹蛋白或其同源物的核酸的表达。
[0050]定义
[0051]多肽/蛋白质
[0052]术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
[0053]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列[0054]术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
[0055]对照棺物
[0056]选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是因分离而丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
[0057]同源物
[0058]蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与从中衍生它们的非修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。
[0059]缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
[0060]插入指一个或多个氨基酸残基被导入蛋白质中的预定位点。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常，在氨基酸序列内部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约I至10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、
二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG? _表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合
肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0061]替换指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，不过根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约I至10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域熟知的(见例如 Creighton (1984) Proteins, ff.H.Freeman and Company (编著)和下表 I)。
[0062]表1:保守性氨基酸替换的例子
[0063]
【权利要求】
1.在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，所述方法包括调节植物中下述核酸的表达，所述核酸编码亚组III Grx多肽，或SCEl多肽，或YEFl多肽，或FT姐妹蛋白，或PRE样多肽，并且其中在所述核酸编码FT姐妹蛋白的情况下，产量相关性状是根茎比的改变，该方法包括调节植物中编码FT姐妹多肽或以增加的优选顺序与SEQ ID NO:440示出的氨基酸序列具有至少 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96 %、97 %、98 %或99 %的整体序列同一性的其同源物的核酸的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中 所述亚组III Grx多肽包含CCxx活性中心，优选地，CCxS活性中心，最优选地，CCMS活性中心；或者 所述SCEl多肽包含下述序列，所述序列具有下述至少之 ⑴与表A2的任何多肽的氨基酸序列50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性； (ii)与实施例4的表C2所示的任何UBC结构域的氨基酸序列50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性;或者 所述YEFl多肽包含NPDl结构域(新颖的蛋白结构域1，Novel Protein Domainl) >RRM(RNA识别基序，ENAEecognition Motif)结构域以及任选地CCCH(C3H锌指)结构域；或者 其中编码FT姐妹多肽或其同源物的核酸在用于构建FT序列的进化系统树时与包含SEQ ID NO:440示出的氨基·酸序列的组聚类，而不与任何其它组聚类；或者 所述PRE样多肽包含一个或多个下述基序:基序I (SEQ ID NO:7)、基序2 (SEQ ID NO:8)和基序 3 (SEQ ID NO:9)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述YEFl多肽包含下述结构域: (i)NPDl结构域或以增加的优选顺序与实施例4的表C3所示的任何NPDl结构域具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性的结构域， (ii)RRM结构域或以增加的优选顺序与实施例4的表C3所示的任何RRM结构域具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性的结构域，且 其中⑴和/或(ii)的结构域以增加的优选顺序出现一次、两次、三次、四次至多达十次。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述YEFl多肽包含下述基序的至少一种: (i)基序I或与SEQID NO:277具有至少75%、80%、85%、90%或95%序列同一性的基序， (ii)基序II 或与 SEQ ID NO:278 具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%序列同一性的基序。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述YEFl多肽包含CCCH结构域或以增加的优选顺序与实施例4的表C3示出的任何CCCH结构域具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高序列同一性的结构域。
6.根据权利要求1或2的方法，其中编码FT姐妹多肽或其同源物的所述核酸是SEQIDNO:1示出的核酸的一部分，或者是编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分，其中所述一部分长度为至少150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810个连续核苷酸，所述连续核苷酸是SEQ ID NO:439的，或是编码SEQ ID NO:440的氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述调节的表达通过在植物中导入和表达编码亚组III Grx多肽、SCEl多肽、YEFl多肽、FT姐妹多肽或其同源物或者PRE样多肽的核酸来实现。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述编码亚组IIIGrx多肽的核酸编码表A4中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸；或者 所述编码SCEl多肽的核酸编码表A2中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸；或者 所述编码YEFl多肽的核酸编码表A3中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分，或者是能够与此类核酸杂交的核酸；或者 所述编码FT姐妹多肽或其同源物的核酸能与SEQ ID NO:439示出的核酸杂交，或能够与编码SEQ ID NO:440的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交；或者 所述编码PRE样多肽的核酸编码表A中所列的任一蛋白质或者是此类核酸的一部分或者是能够与此类核酸杂交的核酸。`
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述编码亚组IIIGrx多肽的核酸序列编码表A4中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物；或者 所述编码SCEl多肽的核酸序列编码表A2中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物；或者 所述编码YEFl多肽的核酸序列编码表A3中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物；或者 所述编码FT姐妹多肽或其同源物的核酸编码SEQ ID NO:440所示的序列的直向同源物或旁系同源物；或者 所述编码PRE样多肽的核酸序列编码表A中所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中在所述核酸编码亚组IIIGrx多肽的情况下，所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的产量、优选提高的生物量和/或提闻的种子广量； 其中在所述核酸编码SCEl多肽的情况下，所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提闻的生物量、优选提闻的枝条和/或根生物量，和/或提闻的种子广量；其中在所述核酸编码YEFl多肽的情况下，所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的产量、优选提高的种子产量；或者 其中在所述核酸编码PRE样多肽的情况下，所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物提高的产量、优选提高的种子产量，条件是所述提高的种子产量不包括提高的种子油含量。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中在所述核酸编码亚组IIIGrx多肽的情况下，所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得； 其中在所述核酸编码SCEl多肽的情况下，所述增强的产量相关性状在缺氮条件下获得; 其中在所述核酸编码YEFl多肽的情况下，所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得，或者在干旱胁迫条件下获得； 其中在所述核酸编码FT姐妹蛋白的情况下，所述改变的根:茎比在非胁迫条件下获得；或者 其中在所述核酸编码PRE样多肽的情况下，所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得，或者在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮条件下获得。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中在所述核酸编码亚组IIIGrx多肽的情况下，所述核酸与绿色组织特异性启动子，优选与原叶绿素酸酯还原酶启动子，最优选与SEQ ID NO:155示出的原叶绿素酸酯还原酶启动子有效连接； 其中在所述核酸编码SCEl多·肽的情况下，所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接； 其中在所述核酸编码YEFl多肽的情况下，所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接； 其中在所述核酸编码FT姐妹蛋白的情况下，所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接；或者 其中在所述核酸编码PRE样多肽的情况下，所述核酸与组成型启动子，优选与GOS2启动子，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中 所述编码亚组III Grx多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae),更优选来自拟南芥属(Arabidopsis),最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)； 所述编码SCEl多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae),最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)； 所述编码YEFI多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自爺科(Solanaceae),更优选来自爺属(Solanum),最优选来自番爺(Lycorpersicumesculentum)； 所述编码FT姐妹多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae),更优选来自拟南芥属(Arabidopsis),最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana);或者 所述编码PRE样多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自禾本科(Poaceae),更优选来自小麦属(Triticum),最优选来自普通小麦(Triticumaestivum)。
14.植物或其部分，其包括种子，通过根据任何前述权利要求的方法可获得，其中 所述植物或其部分包含编码亚组III Grx多肽的重组核酸； 所述植物或其部分包含编码SCEl多肽的重组核酸； 所述植物或其部分包含编码YEFl多肽的重组核酸； 所述植物或其部分包含编码FT姐妹多肽或其同源物的重组核酸；或者 所述植物或其部分包含编码PRE样多肽的重组核酸。
15.经分离的核酸分子，其包含下述中任何一种:
(i)SEQID NO:201 ；SEQ ID NO:203 ；SEQ ID NO:205 ；SEQ ID NO:207 ；SEQ ID NO:209 ；SEQ ID NO:211 和 SEQ ID NO:213 示出的核酸； (ii)与(i)中示出的SEQID NOs中任何一条互补的核酸或其片段； (iii)编码SCEl多肽的核酸，所述多肽以增加的优选顺序具有与SEQID NO:202;SEQ ID NO:204 ；SEQ ID NO:206 ；SEQ ID NO:208 ；SEQ ID NO:210 ；SEQ ID NO:212 和 SEQID NO:214 中示出的任一氨基酸序列至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性； (iv)能与上文(i)、(ii)或(iii)中示出的任一核酸在严格条件下杂交的核酸。
16.经分离的多肽，其包含:
a.以增加的优选顺序与SEQID NO:202 ；SEQ ID NO:204 ；SEQ ID NO:206 ；SEQ ID NO:208 ；SEQ ID NO:210 ；SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:214中示出的任何一条氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的氨基酸序列； b.能与(i)中给出的任何氨基酸的衍生物杂交的核酸。
17.构建体，其包含 (i)编码在权利要求1或2中定义的亚组IIIGrx多肽的核酸；或编码在权利要求1、2、或16中定义的SCEl多肽的核酸或根据权利要求15的核酸；或编码在权利要求1-5中任一项定义的YEFl多肽的核酸；或编码在权利要求1、2和6中任一项中定义的FT姐妹多肽或其同源物的核酸；或编码在权利要求1或2中定义的PRE样多肽的核酸； (ii)一个或多个调控序列，其能够驱动(a)的核酸序列的表达；以及任选地 (iii)转录终止序列。
18.根据权利要求17的构建体，其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1或2中定义的亚组III Grx多肽的核酸的情况下，所述调控序列之一是绿色组织特异性启动子，优选原叶绿素酸酯还原酶启动子，最优选SEQ ID NO:436示出的原叶绿素酸酯还原酶启动子；或者 其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1、2、或16中定义的SCEl多肽的核酸或根据权利要求15的核酸，或编码在权利要求1-5中任一项定义的YEFl多肽的核酸，或编码在权利要求1、2和6中任一项中定义的FT姐妹多肽或其同源物的核酸，或编码在权利要求1或2中定义的PRE样多肽的核酸的情况下，所述调控序列之一是组成型启动子，优选G0S2启动子，最优选来自稻的G0S2启动子。
19.根据权利要求17或18的构建体在下述方法中的用途，其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1或2中定义的亚组IIIGrx多肽的核酸的情况下，所述方法用于制备相对于对照植物具有提闻的广量，特别是提闻的生物量和/或提闻的种子广量的植物； 其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1、2、或16中定义的SCEl多肽的核酸或根据权利要求15的核酸的情况下，所述方法用于制备相对于对照植物具有提高的产量，特别是提闻的生物量，和/或提闻的种子广量的植物； 其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1-5中任一项定义的YEFl多肽的核酸的情况下，所述方法用于制备相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的生物量和/或提高的种子产量的植物； 其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1、2和6中任一项中定义的FT姐妹多肽或其同源物的核酸的情况下，所述方法用于制备相对于对照植物具有改变的根:茎比的植物；或者 其中在(i)中的核酸为编码在权利要求1或2中定义的PRE样多肽的核酸的情况下，所述方法用于制备相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的种子产量的植物。
20.用根据权利要求17或18的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
21.用于产生转基因植物的方法，其中 所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的生物量和/或提高的种子产量，所述方法包括: (i)在植物中导入和表达编码如权利要求1或2中所定义的亚组IIIGrx多肽的核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞；或者 所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的种子产量，所述方法包括: (i)在植物中导入和表达编码权利要求1、2或16中定义的SCEl多肽的核酸，或根据权利要求15的核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞，以及任选地 (iii)选择具有增强的产量相关性状的植物；或者 所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的生物量和/或提高的种子产量，所述方法包括: (i)在植物中导入和表达编码如权利要求1-5中任一项所定义的YEFl多肽的核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞；或者 所述植物相对于对照植物具有改变的根:茎比，所述方法包括: (i)在植物中导入和表达编码如权利要求1、2和6中任一项中所定义的FT姐妹多肽或其同源物的核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞；或者 所述植物相对于对照植物具有提高的产量，特别是提高的生物量和/或提高的种子产量，所述方法包括: (i)在植物中导入和表达编码如权利要求1或2中所定 义的PRE样多肽的核酸；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
22.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述转基因植物相对于对照植物具有提闻的广量、特别是提闻的生物量和/或提闻的种子产量，获得自编码如权利要求1或2所定义的亚组III Grx多肽的核酸的调节的表达；或者 所述转基因植物相对于对照植物具有提闻的广量、特别是提闻的生物量，和/或提闻的种子产量，获得自编码如权利要求1、2或16中定义的SCEl多肽的核酸的调节的表达；或者 所述转基因植物相对于对照植物具有提闻的广量、特别是提闻的生物量和/或提闻的种子产量，获得自编码如权利要求1-5中任一项所定义的YEFl多肽的核酸的调节的表达；或者 所述转基因植物相对于对照植物具有改变的根:茎比，获得自编码如权利要求1、2和6中任一项所定义的FT姐妹多肽或其同源物的核酸的调节的表达；或者 所述转基因植物相对于对照植物具有提高的产量、特别是提高的种子产量，获得自编码如权利要求1或2所定义的PRE样多肽的核酸的调节的表达。
23.根据权利要求14、20或22的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，例如稻、玉米、小麦、大麦、谷子(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱、二粒小麦(emmer)、斯佩尔特小麦(spelt)、黑麦属(secale)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、蜀黍(milo)和燕麦。
24.根据权利要求23的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
25.来自根据权利要求23的植物和/或来自根据权利要求24的植物可收获部分的产品O`
26.编码亚组IIIGrx多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高产量，特别是提高种子产量和/或枝条生物量中的用途；或者编码SCEl多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高产量，特别是提高枝条和/或生物量，和/或提高种子产量中的用途；或者编码YEFl多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高产量，特别是提高种子产量和/或枝条生物量中的用途；或者编码FT姐妹多肽或其同源物的核酸在相对于对照植物改变植物的根:茎比中的用途；或编码PRE样多肽的核酸在相对于对照植物在植物中提高产量，特别是提高种子产量中的用途。
【文档编号】C12N15/82GK103849647SQ201410036361
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2009年1月23日 优先权日:2008年1月25日
【发明者】Y·海茨费尔德, V·弗兰卡德, C·勒佐, A·I·桑兹莫林纳罗, S·范德纳比利 申请人:巴斯夫植物科学有限公司