专利名称：一种田间试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法
技术领域：
本发明涉及植物生理生态学研究技术领域，特别涉及在田间试验活体条 件下，无损伤、定位大量取样、以研究植物气孔特征及其动态变化的技术方法。
背景技术：
叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，叶片光合作用所需要 的C02是通过气孔从大气中进人叶片内部的。与此同时，植物体内的水分通
过叶片的蒸腾作用从气孔散失到大气中，因此，叶表皮气孔的形态、数量以 及分布与叶片的生理功能密切相关。另外，也与植物的生长环境密切相关。
在种质资源的评价中，气孔作为重要的植物学性状之一，可作为观察记 载项目。气孔是在自然选择和人工选择f保留下来的重要器官，具有较大的 稳定性，因而它可以用来研究植物的亲缘关系、演化过程、生态型、染色体 特性和地理起源。同属不同种的植物间一般气孔密度及气孔长度的变化相对 较小，而不同属的植物则变化较大。气孔密度、气孔保卫细胞叶绿体数目与 倍性相关。李润唐等认为气孔形态可以作为研究果树遗传育种，区别品种、 类型的重要微观特征。由此可见，气孔观察方法的研究是植物学研究中的一
项重要内容(闰忠业，2007)。
王晓涧等(2006)用透明胶带法研究了试管苗的气孔特征，可以为阐明 试管苗的形态特征与驯化移栽提供依据。
邵科等(2008)开展了子叶气孔法选择甜菜新品种的初步研究，研究结果表明，甜菜子叶气孔密度是其品种的特性，高糖型甜菜子叶气孔密度明显 大于丰产型品种，与含糖率密切相关，可作为选择高糖型品种的指标。选择 时期是在苗期4片真叶末期，这种选择方法具有活体、简便和较为准确的特 点，对提高选择效率、加速选育进程具有重要的理论和实践意义。
目前，观察植物叶片气孔的方法有多种，如水装片法、印迹法、电子显 微镜法等。
水装片法，即取植物叶片，撕取其下表皮制成临时装片，在显微镜下观 察。这种方法往往不能反映气孔的真实状况，大多情况下气孔关闭。谢国富
等(2007)采用该方法研究认为蚌兰是观察气孔和探究植物细胞吸水及失水 的好材料。
印迹法，即在植物叶的表面涂抹牛皮胶液、火棉胶液法或醋酸纤维素胶 液，胶体风干后就凝成薄膜，此膜就印有表皮组织各细胞的界迹边痕及气孔 结构，较能代表当时气孔的状况，如开度，但操作较麻烦，也不易制片成功。 黄丽萍等(2008)用火棉胶法研究了 36个枣树品种的气孔特征与裂果的关系； 马之胜等(2008)用火棉胶法研究了桃树叶片气孔形状与大小气孔分布，证 明气孔特征与桃树进化有关。
酸解离法10%的硝酸溶液和10 %的铬酸溶液按1:1比例混合，配成叶 片解离液。叶片取lcn^大小左右。用叶片解离液浸泡16-20h,解离后用镊子 取出下表皮，用清水浸洗，在光学显微镜下观察，用测微尺测量视野直径(D)， 调查每视野的气孔数目。
粘取法用普通塑料透明胶带粘取叶片下表皮观察植物气孔比印迹法和 撕取下表皮观察气孔的方法具有操作简单、速度快、真实性强的优点，尤其适宜于试管苗等幼嫩材料的气孔变化动态和形态学指标的研究(陈佰鸿等， 2004)。此法可以防止因保卫细胞失水而导致气孔开张度的变化，能真实地观 察植物不同阶段和时期气孔的变化动态。单独使用胶带纸法，由于叶片厚度 不均匀，叶片有凹凸或由于叶脉等影响，不能够保证整个视野均匀拷贝叶片
下表面，取样面积只有叶面积的70 80%，影响气孔密度等结果统计的准确性， 对表皮毛多或有覆盖物的叶子效果亦不太好。
固定法将每个处理所测叶子中部剪下，面积约60cm2，用FAA(50。/。乙 醇，5%冰醋酸，10%甲醛，35%蒸馏水)固定，带回实验室观察。选叶子中部 近叶脉处，用解剖刀从叶正面刮下叶肉留下表皮制片。用OLYMPUS (AHBS) 数字显微镜观察、拍照，用计算机图像处理系统测量(高志英等，2008)。
陈温福等(2000)发明了稻叶气孔性状研究新方法一一脱硅刮制法。该 方法通过对材料的固定、脱硅、刮制、染色和透明，最终做成可永久保存的 封藏片。脱硅刮制法所用设备和试剂少、操作简便易行、具有图像清晰、观 测结果准确等优点；但不足之处是叶片在离体条件下进行、所看到的气孔处 于关闭状态，所以不能用于气孔开闭状况或开度变化规律的研究，成为该方 法的致命缺点。
用荧光显微镜观察植物叶表皮的气孔，不需做任何处理，可以直接观察 植物叶表皮上的气孔器，而且能很方便地观察到气孔的形态、密度以及气孔 开闭程度等变化情况，为植物显微技术研究找到了一种新的气孔观察方法(崔 宏安，2007)，但需要设备配置较高，叶片需要离体。
封涛(200S)对铬酸离析法进行改良，建立了适合单子叶植物的气孔取样 观察方法。齐红岩等(2009)研究水分亏缺对番茄叶片气孔特性及叶绿体超微结构 的影响，方法是在叶片中部叶脉与叶片边缘之间切取1 2 mn^见方小块，用 2.5%戊二醛前固定，1°/。锇酸后固定。按常规系列乙醇丙酮脱水，醋酸异戊脂 置换，在液态C02中干燥后进行样品粘合，对其进行喷金处理，在S-450型 扫描电子显微镜下观察各处理叶片气孔数目与气孔开放程度，测量气孔器的 横径及纵径的长度，统计气孔开闭情况，测量气孔长和宽并计算气孔密度， 选取几个有代表性的视野照相。
以上几种观察气孔的方法均有一定的优点和可操作性，有些方法简单、 花费小，易于操作但观察到的气孔往往呈关闭状态；有些尽管精确度高但操 作复杂或需要精密仪器。这些方法都有一定的局限，如受叶片的质地、叶表 皮毛或表皮附属物以及制片效果的影响，更重要的是对气孔特性野外取样、 动态特征等研究受到限制。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明目的在于提供一种田间 试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法。该方法具有可在田间活体叶片大 量取样，对叶片无损伤，可定位记录气孔状况，可以观察不同处理条件下叶 片气孔的日变化等，可以用于生物生态学、植物生理学、植物种质资源学、 育种学、栽培学等领域的研究与实践。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种田间试验无损伤定 位观察植物气孔的取样方法，其特征在于，包括下列步骤
1)根据试验设计，选择功能叶片，避免过老、过嫩、病虫害与畸形叶片， 将对象叶片清洗干净；2) 在拟观察部位均匀薄薄的涂布一层指甲油，约5~10mmX5~10mm，
自然干燥或用洗耳球吹至近干，有毛的叶片先将待测部位涂布一层指甲油干 燥后揭去，再重新涂布指甲油用于取样；
3) 用透明胶带贴于指甲油膜上，中心部位对准；
4) 缓慢连同指甲油膜一起揭下，用解剖针辅助使指甲油膜与叶片分离；
5) 将揭取的胶带与指甲油膜复合膜平面贴实于干净载玻片上，用解剖针 或洁净刀片缓慢引导以防止气泡，指甲油膜四周必须至少有1 2mm透明胶带 并贴实于载玻片上，把指甲油膜封闭在载玻片上；
6) 根据试验处理编号，同时将编号记录在实验记录本上；
7) 洁净包装，带回实验室后用于显微镜观察与测量。 本发明之取样方法的总体思路是从无损、连续、大量、准确等方面综合
考虑，结合了指甲油印迹法与透明胶带印迹法的优点，改进了制片技术方案， 形成这种实用的田间试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法。
本发明的取样方法适用于农业、林业行业，植物生态学、植物生理学、 植物种质资源学、育种学、栽培学等领域的研究与实践。 与现有技术相比，本发明的具有以下优点
1) 可以用于活体取样，对光合叶片不造成损伤；
2) 可以用于固定部位的气孔观察取样，研究叶片同一部位或同一叶片 多个部位气孔的变化；
3) 可以用于气孔特征的日变化研究取样；
4) 取样制片可以较长时期保存而不会发生气孔膨胀或收縮；
5) 可以用于田间较大量制片，带回实验室后安排时间观察等；6)亦适用于叶片表皮细胞大小与排列的观察、及叶片不同部位(如叶 片中心、叶脉、叶脉周围、叶缘等)不同部位表皮细胞形态等研究。
图1为本发明实施例1木纳格葡萄气孔观察图。
图2为本发明实施例2红地球葡萄气孔观察图。 图3为本发明实施例3温宿红葡萄气孔上午变化观察图。 图4为本发明实施例3温宿红葡萄气孔中午变化观察图。 图5为本发明实施例3温宿红葡萄气孔下午变化观察图。
具体实施例方式
下面结合附图及实例对本发明作进一步详细描述。 实施例1木纳格葡萄气孔观察
2008年8月，在新疆阿克苏地区温宿县托乎拉乡达汗村葡萄长廊，在土 壤与叶面施肥对木纳格葡萄光合特性影响的研究中，就木纳格葡萄叶片气孔 取样研究。方法是根据不同土壤施肥处理与叶面喷肥处理，选取向阳面正常 光合功能叶(一般为枝条基部往上第三或第四片叶)，由于试验地在村庄路边， 灰尘很大，对叶片表面灰尘通过吹，擦、刷等手段洁净。在靠近叶片主叶脉 的部位，仔细的涂布指甲油膜，面积小于lcm2，用口吹加速干燥，用15mm X15mm的透明塑料胶带将已经干燥的指甲油膜揭取下来，迅速粘贴到载玻片 上，用记号笔写上编号，包括处理名、时间等，每处理重复取样3个以上， 包装好，带回实验室后显微观察，结果见图1，左右图(a、 b图)分别为北 京时间12:00， 17:00时的木纳格葡萄的气孔特征。
实施例2红地球葡萄气孔观察2008年8月，在新疆阿克苏地区红旗坡农场，在土壤与叶面施肥对红地 球葡萄光合特性影响的研究中，就红地球葡萄叶片气孔取样研究。方法是根 据不同土壤施肥处理与叶面喷肥处理，选取向阳面正常光合功能叶(枝条基 部往上第三或第四片叶)，先对叶片表面吹、擦干净，在靠近叶片主叶脉的部 位，仔细的涂布指甲油膜，面积5mmX5mm，用洗耳球吹风以加速干燥，用 透明塑料胶带(15mmX15mm)将干燥的指甲油膜揭取下来，迅速粘贴到载 玻片上，每个载玻片均写上编号，包括处理名、时间等，每处理重复取样3 个以上，包装好，带回实验室后显微观察，结果见图2，左右图分别为北京时 间12:00， 17:00时的红地球葡萄的气孔特征。
实施例3温宿红葡萄气孔日变化观察
2008年8月，在新疆阿克苏地区温宿县，温宿红葡萄品种优选的研究中， 就温宿红葡萄叶片气孔取样研究，特别是拟对果实形态表现明显不同的营养 变异系，通过分析气孔开张度等日变化等特性，以期为品种优选提供依据。 方法同实例2，结果见图3 5，图3左右图分别为北京时间10:00， 12:00;图 4分别为14:00， 16:00;图5分别为18:00， 20:00时的温宿红葡萄的气孔特征。
权利要求
1.一种田间试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法，其特征在于，包括下列步骤1)根据试验设计，选择功能叶片，避免过老、过嫩、病虫害与畸形叶片，将对象叶片清洗干净；2)在拟观察部位均匀薄薄的涂布一层指甲油，约5～10mm×5～10mm，自然干燥或用洗耳球吹至近干，有毛的叶片可先将待测部位涂布一层指甲油干燥后揭去，再重新涂布指甲油用于取样；3)用透明胶带贴于指甲油膜上，中心部位对准；4)缓慢连同指甲油膜一起揭下，用解剖针辅助使指甲油膜与叶片分离；5)将揭取的胶带与指甲油膜复合膜平面贴实于干净载玻片上，用解剖针或洁净刀片缓慢引导以防止气泡，指甲油膜四周必须至少有1～2mm透明胶带并贴实于载玻片上，把指甲油膜封闭在载玻片上；6)根据试验处理编号，同时将编号记录在实验记录本上；7)洁净包装，带回实验室后用于显微镜下观察与测量。
全文摘要
本发明公开了一种田间试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法，包括下列步骤根据试验设计，选择功能叶片，避免过老、过嫩、病虫害与畸形叶片，将对象叶片清洗干净；在拟观察部位均匀薄薄的涂布一层指甲油，自然干燥或用洗耳球吹至近干；用透明胶带平面贴实于干净载玻片上，用解剖针或洁净刀片缓慢引导以防止气泡，指甲油膜四周必须至少有2mm宽的胶带并贴实至载玻片上；编号，洁净包装，带回实验室用于显微观察与测量。该方法具有可在田间活体叶片大量取样，对叶片无损伤，可定位记录气孔状况，可以观察不同处理条件下叶片气孔的日变化等，可以用于生物生态学、植物生理学、植物种质资源学、育种学、栽培学等领域的研究与实践。
文档编号G01N21/84GK101556215SQ20091002247
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者丁家华, 张宗勤, 张朝红, 王跃进, 薇 纪 申请人:西北农林科技大学