专利名称：一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法
技术领域：
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法。
背景技术：
夹竹桃indicum Mill.)是夹竹桃科(Apocynaceae)—种常见植物，在《植物学》、《植物生物学》和《植物解剖学》等各类教科书与实验教材中，几乎都是以夹竹桃的叶片结构作为旱生植物的典型叶来讲述。 夹竹桃叶的上、下表皮都是复层表皮，其气孔器只生长在下表皮下陷于叶肉组织内的气孔窝中，在下表皮表面只能看见气孔窝的开口，无法观察到气孔器及其周围表皮。通常只能通过夹竹桃叶的横切片观察到其气孔窝与气孔器的纵切结构，无法观察到气孔窝内叶表皮的细胞形状与气孔器构成。由于夹竹桃叶气孔窝的这种特殊结构，使得各类叶表皮制片方法均无法获得其气孔窝的叶表皮制片，夹竹桃气孔窝的叶表皮制片因此成为叶表皮制片技术上的一个难题。
发明内容
为克服以上现有技术的缺点，本发明提供一种操作简单，能够观察到夹竹桃气孔窝内的叶表皮细胞形状与气孔器构成的制片方法。为达到上述目的，本发明提供一种夹竹桃的气孔窝叶表皮的制片方法，所述方法为取材和制片，包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。夹竹桃叶的横切制片的具体步骤如下
I)将新鲜的夹竹桃叶放在解剖镜的视野中，先将叶片不需要观察的部分切去，使叶片宽度约为1-1. 5 Cm ；
2)沿着与叶片纵轴不平行或平行的方向，用锋利刀片对叶片进行连续横切；
3)切片后，用尖头镊子将切片依次转移到载玻片上，制成水装片，或经过浅染，经冲洗后制片。夹竹桃叶的气孔窝底部的叶表皮制片的具体步骤如下
1)截取适当长度的新鲜夹竹桃叶将其上表皮朝上，放置在解剖镜的视野中，透射光照明并适当放大，选择操作区域；
2)用ImL注射器的针尖将上表皮划破，再将上表皮及其浅层的叶肉组织轻轻挑、刮去；同时在操作表面上及时滴上1-2滴水，或将叶片放入水中洗去刮下残渣并进行补水；
3)当上表皮及部分浅层叶肉组织被除去后，用ImL注射器的针尖挑、刮去各种大小的叶脉及气孔窝周围的叶肉组织；与此同时，利用针尖前端的倾斜面轻轻地刮过气孔窝叶表皮上的叶肉组织，以便将气孔窝叶表皮上附着的海绵组织顺势轻轻地刮去；
4)当制片区域的绝大部分叶肉组织被挑、刮去后，将此制片区域剪下，转移到载玻片上，将其下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相；
5)将叶表皮转移到载玻片上后，滴上水和染液进行浅染，使气孔窝周围的细胞颜色较气孔窝叶表皮细胞的颜色稍浅，且气孔窝叶表皮的染色不要太深；染色时，在载玻片上罩上防染色液蒸发的培养皿；染色后，经过漂洗，将下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相。夹竹桃叶横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片过程中，浅染的染液均可以是O. 1%番红水溶液、O. 1%固绿染液或其他染液。
夹竹桃叶横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片过程中浅染，其进行染色时O. 1%番红水溶液浅染的时间均可以是5-10分钟，或根据染色效果，适当缩短或延长染色时间
夹竹桃叶横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片过程中浅染，其进行染色时O. 1%固绿染液浅染的时间均可以是1-2分钟，或根据染色效果，适当缩短或延长染色时间。本发明采用叶的徒手横切制片和显微操作方法，简化了制片程序，缩短了制片时间，虽然切片的厚度要比切片机制作的切片厚一些，但观察时通过显微镜的精细调焦，却增加了观察到气孔窝侧壁叶表皮细胞形状与气孔器构成的概率。利用本发明这种制片方法，即使不能将气孔窝叶表皮上附着的所有叶肉细胞彻底除去，但通过浅染色和观察时对显微镜的精细调焦，就可较好地观察到气孔窝底部的叶表皮细胞形状及其气孔器构成。本发明通过一种简单的制片方法，解决了夹竹桃气孔窝叶表皮的制片难题，获得了夹竹桃气孔窝的叶表皮制片。由于夹竹桃气孔窝形状不规则、底部不平整，表皮毛长而多，气孔器在气孔窝底部和侧壁的表皮上均存在，并且气孔器向气孔窝内凸出，这些因素使夹竹桃气孔窝的立体结构比较复杂。在对夹竹桃气孔窝的叶表皮细胞及气孔器进行观察时，要将气孔窝开口、气孔窝纵切面、气孔窝底部的叶表皮细胞观察结合起来，这样才能对夹竹桃气孔窝的叶表皮细胞形状及气孔器的结构产生一个立体而全面的认识。
图I:夹竹桃叶的下表皮，示气孔窝开口(荧光观察);
图2 :—部分气孔窝开口的放大(已染色)；
图3 : —个气孔窝开口的放大(已染色)，照片经过光学信息处理和放大 图4 :一个气孔窝的纵切片；
图5 :—个气孔窝的纵切片(荧光观察)；
图6 :—个气孔窝的纵切片(荧光观察)；
图7 :—个气孔窝的纵切片(荧光观察)；
图8 :两个开口合并的气孔窝的纵切片(荧光观察)；
图9 :位于叶肉组织中的、未与表皮相连的两个气孔窝(荧光观察)；
图10 : —个位于叶肉组织中的气孔窝；
图11 :夹竹桃气孔窝底部的叶表皮制片，示一个完整的气孔窝底部的叶表皮(未染色) 图12 :上图的放大，示气孔窝底部的部分叶表皮及气孔器；
图13 : —个气孔窝底部的叶表皮及气孔器的放大 图14 :一个气孔窝底部的叶表皮及气孔器(已染色)；
图15 :图14气孔窝底部的部分叶表皮的放大；
图16 :—个气孔窝底部的部分叶表皮及气孔器的放大(已染色)；
图17 :—个气孔窝底部的叶表皮细胞及气孔器(荧光观察)；
图18 :图10的气孔窝放大；
图19 :气孔窝侧壁上的气孔器；图20 :气孔窝侧壁上的气孔器；
图21 :气孔窝侧壁上的气孔器(荧光观察)；
图22 :图19的放大，示气孔窝侧壁上的气孔器；
图23 :气孔窝侧壁上的气孔器的放大；
图24 :图21的放大，示气孔窝侧壁上的气孔器。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的制片方法作进一步的详细说明。
实施例I :
一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法，所述方法为取材和制片，叶片采自河南省洛阳市庭院内栽植的夹竹桃，其制片方法包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。I.夹竹桃叶的横切制片
1)将新鲜的夹竹桃叶放在解剖镜的视野中，先将叶片不需要观察的部分切去，使叶片宽度约为I Cm ；
2)沿着与叶片纵轴平行的方向，用锋利刀片对叶片进行连续横切，横切片尽可能薄一
ith .
--，
3)切片后，用尖头镊子将切片依次转移到载玻片上，制成水装片。2.夹竹桃叶的气孔窝底部叶表皮的制片
1)截取适当长度的新鲜夹竹桃叶将其上表皮朝上，放置在解剖镜的视野中，以透射光照明并适当放大，选择操作区域，左手压住夹竹桃叶片，右手以ImL注射器开始进行操作；
2)用ImL注射器的针尖将上表皮划破，将上表皮及其浅层的叶肉组织轻轻挑、刮去，尽可能不伤及气孔窝的叶表皮细胞；为了防止操作时叶表皮失水皱缩，同时在操作表面上及时滴上2滴水；
3)当上表皮及部分浅层叶肉组织被除去后，用ImL注射器的针尖轻轻地挑、刮去各种大小的叶脉及气孔窝周围的叶肉组织；与此同时，利用针尖前端的倾斜面轻轻地刮过气孔窝叶表皮上的叶肉组织，以便将气孔窝叶表皮上附着的海绵组织顺势轻轻地刮去；
4)当制片区域的绝大部分叶肉组织被挑、刮去后，将此制片区域剪下，转移到载玻片上，将其下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相；
5)将叶表皮转移到载玻片上后，滴上水和O.1%番红水溶液进行浅染6分钟，使气孔窝周围的细胞颜色较气孔窝叶表皮细胞的颜色稍浅，且气孔窝叶表皮的染色不要太深；染色时，在载玻片上罩上防染色液蒸发的培养皿；染色后，经过漂洗，将下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相。实施例2:
一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法，所述方法为取材和制片，叶片采自河南省洛阳市庭院内栽植的夹竹桃，其制片方法包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。I.夹竹桃叶的横切制片
I)将新鲜的夹竹桃叶放在解剖镜的视野中，先将叶片不需要观察的部分切去，使叶片宽度约为I. 2 cm ；
2)沿着与叶片纵轴垂直的方向，用锋利刀片对叶片进行连续横切，横切片尽可能薄一
ith .
--，
3)切片后，用尖头镊子将切片依次转移到载玻片上，经过O.1%番红染液浅染5分钟，然后经冲洗后制片。2.夹竹桃叶的气孔窝底部叶表皮的制片
1)截取适当长度的新鲜夹竹桃叶将其上表皮朝上，放置在解剖镜的视野中，以透射光照明并适当放大，选择操作区域，左手压住夹竹桃叶片，右手以ImL注射器开始进行操作；
2)用ImL注射器的针尖将上表皮划破，将上表皮及其浅层的叶肉组织轻轻挑、刮去，尽可能不伤及气孔窝的叶表皮细胞；为了防止操作时叶表皮失水皱缩，同时在操作表面上及时滴上I滴水；
3)当上表皮及部分浅层叶肉组织被除去后，用ImL注射器的针尖轻轻地挑、刮去各种大小的叶脉及气孔窝周围的叶肉组织；与此同时，利用针尖前端的倾斜面轻轻地刮过气孔窝叶表皮上的叶肉组织，以便将气孔窝叶表皮上附着的海绵组织顺势轻轻地刮去；
4)当制片区域的绝大部分叶肉组织被挑、刮去后，将此制片区域剪下，转移到载玻片上，将其下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相；
5)将叶表皮转移到载玻片上后，滴上水和O.1%番红水溶液进行浅染10分钟，使气孔窝周围的细胞颜色较气孔窝叶表皮细胞的颜色稍浅，且气孔窝叶表皮的染色不要太深；染色时，在载玻片上罩上防染色液蒸发的培养皿；染色后，经过漂洗，将下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相。实施例3
一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法，所述方法为取材和制片，叶片采自河南省洛阳市庭院内栽植的夹竹桃，其制片方法包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。I.夹竹桃叶的横切制片
1)将新鲜的夹竹桃叶放在解剖镜的视野中，先将叶片不需要观察的部分切去，使叶片宽度约为I. 4 Cm ；
2)沿着与叶片纵轴不平行的方向，用锋利刀片对叶片进行连续横切，横切片尽可能薄
——胜.
--，
3)切片后，用尖头镊子将切片依次转移到载玻片上，经过O.1%番红染液浅染10分钟，然后经冲洗后制片。2.夹竹桃叶的气孔窝底部叶表皮的制片
1)截取适当长度的新鲜夹竹桃叶将其上表皮朝上，放置在解剖镜的视野中，以透射光照明并适当放大，选择操作区域，左手压住夹竹桃叶片，右手以ImL注射器开始进行操作；
2)用ImL注射器的针尖将上表皮划破，将上表皮及其浅层的叶肉组织轻轻挑、刮去，尽可能不伤及气孔窝的叶表皮细胞；为了防止操作时叶表皮失水皱缩，同时将叶片放入水中洗去刮下残渣并进行补水；
3)当上表皮及部分浅层叶肉组织被除去后，用ImL注射器的针尖轻轻地挑、刮去各种大小的叶脉及气孔窝周围的叶肉组织；与此同时，利用针尖前端的倾斜面轻轻地刮过气孔窝叶表皮上的叶肉组织，以便将气孔窝叶表皮上附着的海绵组织顺势轻轻地刮去；
4)当制片区域的绝大部分叶肉组织被挑、刮去后，将此制片区域剪下，转移到载玻片上，将其下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相；
5)将叶表皮转移到载玻片上后，滴上水和O.1%固绿染液进行浅染的时间约2分钟，使气孔窝周围的细胞颜色较气孔窝 叶表皮细胞的颜色稍浅，且气孔窝叶表皮的染色不要太深；染色时，在载玻片上罩上防染色液蒸发的培养皿；染色后，经过漂洗，将下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相。实施例4
一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法，所述方法为取材和制片，叶片采自河南省洛阳市庭院内栽植的夹竹桃，其制片方法包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。I.夹竹桃叶的横切制片
1)将新鲜的夹竹桃叶放在解剖镜的视野中，先将叶片不需要观察的部分切去，使叶片宽度约为I. 5 Cm ；
2)沿着与叶片纵轴平行的方向，用锋利刀片对叶片进行连续横切，横切片尽可能薄一
ith .
--，
3)切片后，用尖头镊子将切片依次转移到载玻片上，经过O.1%固绿染液浅染2分钟，然后经冲洗后制片。2.夹竹桃叶的气孔窝底部叶表皮的制片
1)截取适当长度的新鲜夹竹桃叶将其上表皮朝上，放置在解剖镜的视野中，以透射光照明并适当放大，选择操作区域，左手压住夹竹桃叶片，右手以注射器开始进行操作；
2)用注射器的针尖将上表皮划破，将上表皮及其浅层的叶肉组织轻轻挑、刮去，尽可能不伤及气孔窝的叶表皮细胞，为了防止操作时叶表皮失水皱缩，同时将叶片放入水中洗去刮下残渣并进行补水；
3)当上表皮及部分浅层叶肉组织被除去后，用注射器的针尖轻轻地挑、刮去各种大小的叶脉及气孔窝周围的叶肉组织；与此同时，利用针尖前端的倾斜面轻轻地刮过气孔窝叶表皮上的叶肉组织，以便将气孔窝叶表皮上附着的海绵组织顺势轻轻地刮去；
4)当制片区域的绝大部分叶肉组织被挑、刮去后，将此制片区域剪下，转移到载玻片上，将其下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相；
5)将叶表皮转移到载玻片上后，滴上水和O.1%固绿染液进行浅染的时间约I分钟，使气孔窝周围的细胞颜色较气孔窝叶表皮细胞的颜色稍浅，且气孔窝叶表皮的染色不要太深；染色时，在载玻片上罩上防染色液蒸发的培养皿；染色后，经过漂洗，将下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相。照相和部分数码照片的光学信息处理方法
对制片进行观察时，使用荧光显微镜在普通光及荧光视野中进行观察。对显微镜或解剖镜下的观察结果进行照相时，先将数码相机设置为“微距拍摄”模式，并关闭闪光灯，然后使用数码相机直接对着显微镜或解剖镜的目镜进行拍照。在选择好要拍照的观察结果后，还可以利用数码相机自带的放大功能对物像进行清晰放大后，再进行拍照。为使结构观察更清楚，个别数码照片采用了光学信息解析方法进行了处理，但绝大部分数码照片未经处理。结果与分析
I.夹竹桃气孔窝的观察
夹竹桃气孔窝在下表皮上的开口不规则(图1)，一些气孔窝的开口约为三角状圆形或椭圆形(图2)，在气孔窝的开口和气孔窝内，有一些由气孔窝表皮细胞外壁向气孔窝腔中伸出的细长表皮毛(图3-4)。从夹竹桃气孔窝的纵切片上看，气孔窝腔的形状不规则，底部不平整(图4-7)，有时可见气孔窝的开口合并、生长在一起(图1，8)。在气孔窝的纵切片上,有一些气孔窝未见与下表皮之间联系的孔道(图9-10)，说明气孔窝的开口一般比 气孔窝腔要小或短(图5，7，9)。对一个位于叶肉组织中的纵切气孔窝进行观察，可见气孔窝的底部与海绵组织相连，其上端是栅栏组织(图10)。2.夹竹桃气孔窝叶表皮及气孔器的观察
挑、刮去夹竹桃的上表皮和叶肉组织后，不经染色或经浅染色后制片，能观察到夹竹桃气孔窝底部的叶表皮细胞形状与气孔器构成(图11-16)。对夹竹桃气孔窝底部的叶表皮制片进行荧光观察，可观察到气孔窝叶表皮上的圆形气孔器轮廓和表皮毛在表皮上的开口，两个保卫细胞的形态可辨(图17)。对图10的气孔窝进行放大观察，可见气孔窝内的叶表皮由单层细胞组成，在气孔窝底部表皮上，构成气孔器的细胞向气孔窝腔内显著凸出，其周围有细长的表皮毛从气孔窝叶表皮细胞的外壁伸出，伸入到气孔窝腔中(图18)。在叶的横切片上，可观察到在一些气孔窝的纵切结构上，出现了部分叶表皮和气孔器的表面观，此为气孔窝侧壁上的叶表皮及气孔器(图19-24)。从观察结果上看，在气孔窝底部和侧壁的叶表皮上均生有气孔器(图18-21)。经过以上实施例我们可以得出，本发明采用叶的徒手横切制片和显微操作方法，简化了制片程序，缩短了制片时间，观察到了夹竹桃气孔窝内的叶表皮细胞形状与气孔器构成，从而使人们对夹竹桃气孔窝的叶表皮细胞形状及气孔器的结构产生一个立体而全面的认识。
权利要求
1.一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法，其特征在于所述方法为取材和制片，制片方法包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。
2.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于竹桃叶的横切制片的具体步骤如下 1)将新鲜的夹竹桃叶放在解剖镜的视野中，先将叶片不需要观察的部分切去，使叶片宽度约为1-1. 5 Cm ； 2)沿着与叶片纵轴不平行或平行的方向，用刀片对叶片进行连续横切； 3)切片后，用尖头镊子将切片依次转移到载玻片上，制成水装片，或经过浅染，冲洗后制片。
3.根据权利要求I所述的制片方法，其特征在于夹竹桃叶的气孔窝底部的叶表皮制片的具体步骤如下 1)截取适当长度的新鲜夹竹桃叶将其上表皮朝上，放置在解剖镜的视野中，透射光照明并适当放大，选择操作区域； 2)将上表皮划破，再将上表皮及其浅层的叶肉组织轻轻挑、刮去；同时在操作表面上及时滴上1-2滴水，或将叶片放入水中洗去刮下残渣并进行补水； 3)当上表皮及部分浅层叶肉组织被除去后，挑、刮去各种大小的叶脉及气孔窝周围的叶肉组织；与此同时，利用针尖前端的倾斜面轻轻地刮过气孔窝叶表皮上的叶肉组织，以便将气孔窝叶表皮上附着的海绵组织顺势轻轻地刮去； 4)当制片区域的绝大部分叶肉组织被挑、刮去后，将此制片区域剪下，转移到载玻片上，将其下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相； 5)将叶表皮转移到载玻片上后，滴上水和染液进行浅染；染色后，经过漂洗，将下表皮的表面朝下制成水装片，即可观察和照相。
4.根据权利要求1、2或3所述的制片方法，其特征在于夹竹桃叶横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片过程中浅染的染液均可以是O. 1%番红水溶液、O. 1%固绿染液或其他染液。
5.根据权利要求1、2或3所述的制片方法，其特征在于夹竹桃叶横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片过程中浅染，其进行染色时O. 1%番红水溶液浅染的时间均可以是5-10分钟。
6.根据权利要求1、2或3所述的制片方法，其特征在于夹竹桃叶横切制片和气孔窝底 部的叶表皮制片过程中浅染，其进行染色时O. 1%固绿染液浅染的时间均可以是1-2分钟。
全文摘要
本发明提供了一种夹竹桃叶的气孔窝叶表皮的制片方法，所述方法为取材和制片，包括夹竹桃叶的横切制片和气孔窝底部的叶表皮制片。气孔窝底部的叶表皮制片主要利用显微操作方法，用具有斜面结构的针尖作为解剖器材，通过挑、刮去上表皮和浅层叶肉组织后，在用针尖挑、刮去叶脉与气孔窝周围的叶肉组织时，利用针尖的切削面将气孔窝表皮上附着的叶肉组织刮去。本发明采用叶的徒手横切制片和显微操作方法获得了夹竹桃气孔窝的叶表皮制片,操作简单，简化了制片程序，缩短了制片时间，观察到了夹竹桃气孔窝内侧壁和底部的叶表皮细胞形状与气孔器构成。
文档编号G01N1/28GK102721583SQ20121017849
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者洪亚平 申请人:河南科技大学