改变植物气孔开度和密度的方法

专利名称：改变植物气孔开度和密度的方法
技术领域：
本发明涉及农业科学领域。具体而言，本发明涉及通过改变植物气孔密度和开度来增强植物适应环境能力的方法。
背景技术：
在地球上存在着多种多样的气候条件，包括缺水和富含水资源等复杂的环境，在 不同环境培育出适宜的农作物、经济作物品种等具有重要的意义，这有利于提高环境能源 的利用效率。要培育出适应能力强的作物，就有必要详细了解调节气孔生长发育及运动的机理。高等植物的气孔主要分布在叶表皮，由两个保卫细胞环绕形成，它是植物吸收二 氧化碳和水分进出植物体的必须经过的通道。气孔的生理状态，例如其密度和开关程度，直 接影响植物的许多行为或表型，例如水分蒸腾的速率和光合作用的效率。气孔的生理状态 受很多环境因子的调控，其中光是最重要的的环境因子。植物中有很多光受体来感受光的 方向、质量及数量。这些光受体接受光信号并通过信号传导途径来调控植物的生长发育。植物中普遍存在的光受体基因主要为隐花色素CRY、向光素PHOT、光敏色素PHYA 和PHYB基因。目前已经发现，例如如下植物中包含CRY、PHYA和PHYB基因(包括但不限 于)双子叶植物中的拟南芥菜(十字花科芸苔属)、番茄(茄科番茄属)、烟草(茄科烟草 属)、豌豆(蝶形花科)等，单子叶植物中的水稻(禾本科稻属)、大麦(禾本科大麦属)等， 以及蕨类、苔藓类和藻类中的一些物种。以双子叶模式植物拟南芥菜为例，本领域中已知该植物具有如下的光受体四个 蓝光受体向光素(PH0T1、PH0T2)和隐花色素(CRY1、CRY2)；五个红光/远红光受体光敏 色素phyA、phyB, phyC、phyD、phyE。PHOTl的C端功能区具有经典的苏氨酸/丝氨酸激酶 活性。N端功能区称为LOV功能域(Light Oxygen Voltage domain)。PHOTl通过LOV功能 域感应蓝光，LOVl和L0V2功能域分别都结合一个生色团——核黄素单核苷酸(FMN)。CRYl 和CRY2蛋白N端与光裂解酶(photolyase)具有高水平的氨基酸序列的同源性，不过没有 光裂解酶的活性，同时CRY有一个光裂解酶没有的C端延伸区，常称为C端功能区。CRY蛋 白是通过N端形成二聚体的，通过与之以非共价结合的FAD吸收光信号，C端向下传递光信 号。PHY的生色团结合在光敏色素的N端功能区，但与CRY不同的是其是通过共价键结合 而不是非共价结合。此外，虽然PHY也是二聚体，但是与CRY不同的是PHY 二聚体是通过C 端实现的。光敏色素在红光和远红光下具有不同的分子构象在红光下为Pfr形式，为光敏 色素的活性形式；而在远红光下为Pr形式，为光敏色素的失活形式。光可以逆转Pfr和Pr 两种形式的光敏色素，红光促使光敏色素由Pr型向Pfr型转化，而远红光则逆转该过程。拟南芥菜CRYl基因的登录号为S66907，cDNA序列SEQ ID NO 1所示；其CRY2基 因的登录号为U43397，cDNA序列SEQ ID NO :3所示；其PHYB基因的登录号为X17342，cDNA 序列SEQ ID NO :5所示；其PHYA基因的登录号为NM_001123784，cDNA序列SEQ ID NO 7 所示。
蓝光受体向光素主要参与植物的向光性、叶绿体的运动和蓝光诱导的气孔开放过 程的调节。已有研究证明蓝光受体PHOT和CRY均参与了蓝光诱导的气孔开放。然而，本领域中仅知晓光敏色素PHY在植物光形态建成、开花时间、花色素苷合成 和生物节律性等重要生理过程发挥重要调控作用。目前尚无，红光受体PhyB对气孔生理状 态(如气孔开放和气孔密度)是否具有调节作用的相关报道。本领域迫切需要研究出对植物气孔生理状态具有影响作用的因素，以开发出调节 植物行为或表型(尤其是水分蒸腾和光合作用的效率)的有效方法，从而改善植物对环境 的适应能力、提高植物品质。

发明内容
本发明通过揭示植物PHYB基因及其编码的蛋白质或多肽与植物气孔生理状态之 间的相关性，提供了改变植物与气孔生理状态相关的用途和方法，从而改善植物对环境的 适应能力、提高植物品质。在本发明的第一个方面，提供了植物PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽在调节 植物气孔生理状态中的用途。在一个优选例中，所述气孔生理状态为选自下组中的一种或多种气孔开度、气孔 密度、气孔导度或气孔系数。在另一优选例中，所述气孔生理状态的调节包括通过所述PHYB基因或其编码的 蛋白质或多肽的减少或功能的丧失或降低，使得正常植物气孔生理状态受到抑制；或通过 所述PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽的增加或功能的增强，使得正常植物气孔生理状 态受到促进。在一个优选例中，所述抑制包括选自下组的一种或多种气孔开度减小、气孔导度 降低、气孔密度降低或气孔系数减少。在一个优选例中，所述促进包括选自下组的一种或多种气孔开度增大、气孔导度 提高、气孔密度提高或气孔系数增大。在本发明的一个实施方式中，所述植物还同时具有cryl、cry2和/或phyA基因或 其编码的蛋白质或多肽的表达或功能的改变。与本发明的第一方面密切相关的是本发明的第二方面，在该方面中提供了植物 PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽在调节植物与气孔生理状态相关的环境适应性表型或 行为中的用途。在一个优选例中，所述PHYB基因选自(i)SEQ ID NO :5所示的序列；或(ii)在严 格条件下与(i)限定的序列杂交且具有调节植物与气孔生理状态相关的环境适应性活性 的序列。在本发明的一个实施方式中，所述植物选自下组十字花科、茄科、蝶形花科、禾本 科植物、蕨类、苔藓或藻类。在一个优选例中，所述植物选自十字花科芸苔属、茄科番茄属、茄科烟草属、蝶形 花科、禾本科稻属或禾本科大麦属，更优选拟南芥菜、番茄、烟草、豌豆、水稻或大麦。在本发明的另一个实施方式中，所述气孔生理状态为选自下组中的一种或多种 气孔开度、气孔密度、气孔导度或气孔系数。
在本发明的另一个实施方式中，所述植物与气孔生理状态相关的环境适应性表型 或行为为选自下组中的一种或多种叶片失水、水分蒸腾速率、光合作用效率、抗旱节水性、 抗涝适水性或新鲜度保持。在本发明的另一个实施方式中，所述PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽的减少 或功能的丧失或降低，对正常植物气孔生理状态产生抑制作用；所述PhyB基因或其编码的 蛋白质或多肽的增加或功能的增强，对正常植物气孔生理状态产生促进作用。在一个优选例中，所述抑制作用包括选自下组的一种或多种气孔开度减小、气孔 导度降低、气孔密度降低或气孔系数减少。所述促进作用包括选自下组的一种或多种气孔 开度增大、气孔导度提高、气孔密度提高或气孔系数增大。在另一个优选例中，与植物气孔生理状态受到抑制相关的环境适应性表型或行为 包括选自下组中的一种或多种叶片失水减少、水分蒸腾速率下降、光合作用效率降低、抗 旱节水性提高或保鲜时间延长。在另一个优选例中，与植物气孔生理状态受到促进相关的环境适应性植物表型或 行为包括选自下组中的一种或多种叶片失水增加、水分蒸腾速率提高、光合作用效率提高 或抗涝适水性提高。在一个优选例中，所述phyB基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能的改变 通过选自下组的一种或多种方法实现物理诱变、化学诱变、T-DNA插入法、转座子插入法、 小分子RNA干扰、基因敲除或多拷贝表达。在本发明的另一个实施方式中，所述植物还同时具有cryl、cry2和/或phyA基因 或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能的改变。在一个优选例中，所述植物选自下组的cry IphyB双突变体、cry2phyB双突变体、 phyAphyB 双突变体、crylcry2phyB 三突变体、cry IphyAphyB 三突变体、cry2phyAphyB 三突 变体、crylcry2phyAphyB四突变体，其中各基因的表达或功能变化趋势一致。在另一优选 例中，所述突变均为功能缺失突变。因此，在本发明的该方面中，还提供了 phyB或其编码的蛋白质或多肽与cryl、 cry2和/或phyA基因或其编码的蛋白质或多肽的组合在调节植物气孔生理状态中的用途， 以及在调节与植物气孔生理状态相关的环境适应性表型或行为中的用途。在本发明的第三方面中，提供了一种产生与气孔生理状态相关的环境适应性表型 或行为发生改变的植物的方法，所述方法包括改变所述植物中PhyB基因或其编码的蛋白 质或多肽的数量或功能。在一个优选例中，所述植物与正常植物相比，气孔生理状态受到抑制。所述抑制包 括选自下组的一种或多种气孔开度减小、气孔导度降低、气孔系数减小或气孔密度降低。 由此，所述植物具有如下的行为或表型叶片失水减少、水分蒸腾速率下降、光合作用效率 降低、具有改善的抗旱节水性或保鲜时间延长。所述方法包括使得所述植物中PhyB基因 或其编码的蛋白质或多肽减少或功能丧失或降低。在另一优选例中，所述植物与正常植物相比，气孔生理状态受到促进。所述促进包 括选自下组的一种或多种气孔开度增大、气孔导度提高、气孔系数增大或气孔密度提高。 由此，所述植物具有如下的性能叶片失水增加、水分蒸腾速率提高、光合作用效率提高、具 有改善的抗涝耐水(适水)性。所述方法包括使得所述植物中PhyB基因或其编码的蛋白质或多肽增加或功能增强。在另一优选例中，通过选自下组的一种或多种步骤实现所述phyB基因或其编码 的蛋白质或多肽的数量或功能的改变物理诱变、化学诱变、T-DNA插入法、转座子插入法、 小分子RNA干扰、基因敲除或多拷贝表达。在本发明的另一个实施方式中，所述植物是转基因植物或突变体。在一个优选例中，所述方法还包括使所述植物与其它正常植物、突变体或转基因 植物杂交，从而获得与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生改变的杂交后代。在另一个优选例中，杂交用的植物在分类上属于同一科或不同科植物，优选为同 一科植物。所述植物优选为十字花科芸苔属、茄科番茄属、茄科烟草属、蝶形花科、禾本科稻 属或禾本科大麦属，更优选拟南芥菜、番茄、烟草、豌豆、水稻或大麦。在另一个优选例中，所述杂交后代具有稳定的遗传性状。在本发明的另一个实施方式中，所述所述方法还包含改变选自cryl、cry2和/或 PhyA基因或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能。在一个优选例中，所述植物选自下组crylphyB双突变体、cry2phyB双突变体、 phyAphyB 双突变体、cryl cry 2phyB 三突变体、cry IphyAphyB 三突变体、cry2phyAphyB 三突 变体、cryl cry 2phyAphyB四突变体，其中各基因的表达或功能变化趋势一致。在另一优选 例中，所述突变均为功能缺失突变。在本发明的第四方面中，提供了用本发明方法制备的植物的用途，其用于在干旱 或湿涝条件下生产农作物、经济作物或其产品或延长植物或其产品的保鲜时间。在本发明的其它方面，还提供了一种与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生 改变的突变体植物或转基因植物，所述植物中PhyB基因或其编码的蛋白质或多肽的数量 或功能较正常植物发生变化。在一个优选例中，所述植物中phyB基因或其编码的蛋白质或多肽减少或功能丧 失或降低。与正常植物相比，所述植物的气孔生理状态受到抑制。所述抑制包括选自下组 的一种或多种气孔开度减小、气孔导度降低、气孔系数减小、气孔密度降低。由此，所述植 物具有如下的行为或表型叶片失水减少、水分蒸腾速率下降、光合作用效率降低、具有改 善的抗旱节水性或保鲜时间延长。在另一优选例中，所述植物中phyB基因或其编码的蛋白质或多肽增加或功能增 强。与正常植物相比，所述植物的气孔生理状态受到促进。所述促进包括选自下组的一种 或多种气孔开度增大、气孔导度提高、气孔系数增大或气孔密度提高。由此，所述植物具有 如下的性能叶片失水增加、水分蒸腾速率提高、光合作用效率提高或具有改善的抗涝耐水 (适水)性。在本发明的又一方面，涉及CRYl或CRY2过表达对正常植物气孔生理状态产生 促进作用，所述促进作用包括选自下组的一种或多种气孔开度增大、气孔导度提高、气孔 密度提高或气孔系数增大。本发明由此提供了一种产生具有与促进的气孔生理状态相关 的环境适应性表型或行为的植物的方法，所述方法包括在该植物中提供过表达的CRYl或 CRY2。所述植物叶片失水增加、水分蒸腾速率提高、光合作用效率提高或具有改善的抗涝耐 水(适水)性。在一个优选例中，使所述植物同时具有CRYl过表达、CRY2过表达、PHYB过 表达中的任意两种或三种。
因此，本发明涉及一种改变植物水需求量的方法，该方法包括使该植物的CRY1、CRY2、PHYA和PHYB基因功能丧失、降低或增强。本发明另一方面涉及获得适宜的水量需求 的植物的方法，该方法包括使该植物的CRY1、CRY2、PHYA和PHYB基因功能丧失、降低或增 强。本发明再另一方面涉及一种改变植物开度和密度的方法，该方法包括使该植物的CRY1、 CRY2、PHYA和PHYB基因功能丧失、降低或增强。本发明还涉及CRY 1、CRY2、PHYA和PHYB基 因功能丧失、降低或增强的植物。本发明还涉及CRY1、CRY2、PHYA和PHYB基因在改变植物 气孔密度和开度中的用途。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。


图IA 利用生长约21天的WT (野生型)、phyB、crylcry2、crylcry2phyB植株的离 体莲座叶片进行的失水实验。研究表明最不容易失水的植株为CrylCry2phyB三突变植株。 失水率为散失的水分占起始鲜重的百分比。图示的值为三次测量的平均值与标准差。每一 次的样品大小为5-8片离体莲座叶片。图IB :11~(野生型)、？1^8、(^71(^72、(^71(^72 1^8突变体完整叶片的气孔导度。 测量时的光照强度为250μπιΟ1 ·πΓ2 -S^10野生型植株的气孔导度明显高于phyB、CrylCry2、 crylcry2phyB(氺，P < 0. 05,氺氺，P < 0. 01，t W^t)。图2 :WT、phyB和phyB-ovx黑暗处理后红光诱导的气孔开度。柱状图显示了统计 了至少50个气孔开度平均值士标准差(*，P < 0. 05，#，P < 0. 01，t检验)。白光下的结 果与红光诱导的结果类似。图 3A:显示 WT (野生型)、phyB、crylcry2、crylcry2phyB 突变体在 160 μ mo 1 ·πΓ2 · s—1白光下的气孔开度的激光共聚焦扫描显微镜的照片，样品取自见光发芽 生长约四周(其中在MS培养基上培养一周后，种植到土壤中三周)植株的成熟莲座叶片。图 3Β 显示 WT(野生型)、phyB、cryIcry2、crylcry2phyB 突变体在 160 μ mo 1 · m_2 · s—1白光下的气孔开度统计数据，材料同图3A，气孔开度单位为μ m。phyB 单突变和crylcry2双突变的气孔开度显著小于野生型(*，P < 0. 05)，而CrylCry2phyB的 气孔开度比PhyB单突变和crylcry2双突变的气孔开度还要小，与野生型相比具有极显著 差异(**，P < 0.01)。图4 生长在 160 μ mo 1 W 白光下约四周的 WT、phyA、phyB、cryl、phyAphyB、 cryIphyAphyB突变体的莲座叶的气孔开度统计结果。单突变体中只有phyB的气孔开度明 显小于野生型(*，P < 0. 05)，phyAphyB的气孔开度比phyB单突变的气孔开度要小一些，但 是crylphyAphyB与野生型相比具有极显著差异(**，P < 0. 01)。图5A 生长在混合光(蓝光30 μ mol · m_2 · s—1+红光50 μ mol · m_2 · s—1+远红光 6 μ mol ·πΓ2 · s"1)下的 WT、crylcry2、phyAphyB 和 crylphyAphyB 的莲座叶远轴面气孔发育 状况的干涉相差照片，标尺统一为20 μ m。图5B 柱形图显示气孔系数的统计结果，材料同图5A。气孔系数定义为气孔在整 个表皮细胞中所占的比例。crylcry2、phyAphyB和crylphyAphyB的气孔系数都极显著低 于野生型(**，P < 0. 01)，其中crylphyAphyB的气孔系数最低，甚至显著低于phyAphyB。
具体实施例方式本发明的发明人通过长期而深入的研究发现普遍存在于双子叶和单子叶植物中 的PhyB基因表达及功能的改变对植物气孔生理状态具有非常显著的影响作用当phyB基 因表达或功能增强时，气孔生理状态受到明显促进；反之，当PhyB基因表达或功能降低甚 至丧失时，气孔生理状态受到明显抑制。并且，当PhyB基因与其它光受体基因的表达或功 能同时降低甚至丧失时，气孔生理状态的抑制更为明显。在此基础上，本发明人提供了 PhyB 基因或其编码的蛋白质或多肽在改变与植物气孔生理状态相关的行为或表型中的用途、产 生具有该变化的植物的方法及其在生产中的用途，从而完成了本发明。具体而言，本发明人经研究发现，CRYU CRY2和PHYB过量表达在一定的光强下都 会表现出气孔密度增加的表型，白光下crylcry2和phyAphyB的气孔系数明显低于野生型， 而crylphyAphyB的气孔系数是最低的。通过对气孔开度的分析，本研究发现phyB单突 变体的气孔开度比野生型的小，PhyB过量表达导致气孔开度显著增加。crylcry2phyB和 crylphyAphyB两个三突变体的气孔开度比野生型和其父/母本都更小。通过对这四个光受 体的表达水平和功能(尤其是PHYB)的控制可以同时改变气孔密度和气孔开度，而这两个 指标都与植物的光合效率以及水利用率紧密相关，是改变植物性质的关键环节。本发明可 用于培养抗旱节水或充分利用水资源的供观赏和绿化的园林植物和农作物及经济作物。气孔生理状态及其相关的植物行为或表型在本发明中，“气孔”是指高等植物叶片表皮特有的、由两个肾形(双子叶植物)或 哑铃形(单子叶植物)的保卫细胞围绕而成的小孔，是植物吸收二氧化碳和水分进出植物 体的必经通道。在本发明中，“气孔密度”是指单位面积上气孔的数目。“气孔系数”是气孔个数与 气孔和表皮细胞之和的比值。“气孔开度”是指气孔的孔径，体现了气孔开关的程度，其单位 通常为微米(μ m)。“气孔导度”是指植物气孔传导CO2和水汽的能力，它也是描述气孔开度 的一个指标，通常仪器测定的单位同于蒸腾速率。本领域中已知气孔的生理状态对植物的诸多行为或表型起到重要作用，例如气 孔的密度大小和开关程度直接决定植物水分蒸腾的速率和光合作用的效率，决定叶片失水 和抗旱能力，影响植物或其产品的保鲜时间。例如，气孔密度越大(或气孔系数越大)，开启程度越高(如气孔开度越大、气孔导 度越大)，则植物的水分蒸腾速率和光合作用效率越高。反之，气孔密度越小，开启程度越 低，则植物的水分蒸腾速率和光合作用效率越低，抗旱能力越强，失水较少从而适于延长保 鲜时间。phyB基因及其编码的蛋白质或多肽在本发明中，术语“ phyB基因，，是指植物中普遍存在的光敏色素基因，其编码PHYB 蛋白或多肽。以拟南芥菜为例，PhyB基因的登录号为X17342，cDNA序列如SEQ ID NO :5所 示。通常，其它天然植物的PhyB基因与拟南芥phyB基因可高度同源，或在严格条件下能与 拟南芥PhyB基因序列杂交，或是与拟南芥phyB基因高度同源的家族基因分子。应理解，本 发明中的术语“PhyB基因”还包括非天然的，但与天然植物的phyB基因(尤其是拟南芥 PhyB基因)高度同源、或在严格条件下能与所述phyB基因序列杂交、或是与所述phyB基因高度同源的家族基因，且具有改变植物气孔生理状态的活性的分子。与拟南芥phyB基因高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65% 以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列 相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具 也是本领域周知的，如BLAST。如本文所用，术语“严格条件”是指⑴在较低离子强度和较高温度下的杂交和 洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优 选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。本发明的phyB基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人 工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放 阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备 的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩 增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。在本发明中，术语“PHYB蛋白或多肽”或“phyB基因编码的蛋白质或多肽”指由本 发明的PhyB基因编码的蛋白质或多肽，该定义中也包括具有改变植物气孔生理状态的活 性的上述蛋白质或多肽的变异形式。所述PhyB基因编码的蛋白质或多肽的序列包括但不 限于(a) SEQ ID NO 6 ；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几 个氨基酸且具有改变植物气孔生理状态的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重 组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本 发明中PHYB蛋白或多肽优选由拟南芥phyB基因或其同源基因或家族基因编码。本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以 内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相 似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末 端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的PHYB蛋白 质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有改变植物气孔生理状态的活性。可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知 的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编 码序列来构建转基因植物，并观察该转基因植物的性状是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋 白质或多肽。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。该术语还包括PHYB蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导 突变体、在高或低的严紧度条件下能与PHYB蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白。本发 明还可使用其它多肽，如包含PHYB蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 PHYB蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有PHYB蛋白序列的至少约10个连 续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80 个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能的改变本发明中涉及PhyB基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能的改变，所述改 变包括数量的减少或增加，功能的丧失、降低或增强。本发明中还涉及PhyB基因或其编码 的蛋白质或多肽的上述变化与其它光受体编码基因或它们所编码的蛋白质或多肽的数量 或功能的改变的组合，优选所述改变的趋势是相同的，例如同时发生功能降低。在本发明中，“基因或其编码的蛋白质或多肽功能丧失或者降低”是指所述基因或 蛋白质或多肽的功能全部或者部分的丧失，包括基因表达水平降低或不表达、蛋白质部分 片段缺失导致丧失功能等。“基因或其编码的蛋白质或多肽的减少”是指所述基因或蛋白质 或多肽在植物细胞中的数量的降低。根据发明人的研究，phyB基因或其编码的蛋白质或多肽的减少或功能丧失或者降 低，可导致正常气孔生理状态受到抑制(例如气孔密度减小、气孔开度降低、气孔导度降低 等)，从而使得与气孔生理状态密切相关的植物行为或表型发生相应的变化(例如水分蒸 腾的速率降低和光合作用的效率降低等)。该性质可用于改善植物对环境的适应性，例如改 善植物抗旱节水性，也可用于延长植物或其产品的保鲜时间。在本发明中，“基因或其编码的蛋白质或多肽功能增强”是指所述基因或蛋白质或 多肽的功能的提高，包括基因过表达、点突变导致的功能增强等。“基因或其编码的蛋白质 或多肽的增加”是指所述基因或蛋白质或多肽在植物细胞中的数量的增加，例如构建多拷 贝的。根据发明人的研究，phyB基因或其编码的蛋白质或多肽的增加或功能增强，可导 致正常气孔生理状态受到促进(例如气孔密度变大、气孔开度提高、气孔导度提高等)，从 而使得与气孔生理状态密切相关的植物行为或表型发生相应的变化(例如水分蒸腾的速 率提高和光合作用的效率提高等)。该性质可用于改善植物对环境的适应性，例如改善植物 抗涝耐(适)水性，也可用于通过提高植物的光合作用效率提高产量或缩短生长周期。本发明使CRY或PHYB基因功能增强的方法并不限于上述方法，任何能使CRY或 PHYB基因功能增强的方法都可以用于实施本发明的技术方案。本发明人通过研究还发现，在使得植物中phyB基因或其编码的蛋白或多肽功能 丧失或降低的同时，使其它光受体编码基因(例如Cryl、Cry2、phyA等)或其编码的蛋白 质或多肽的功能丧失或者降低，可更显著地抑制的正常气孔生理状态。由此，通过构建含有 PhyB功能丧失或降低突变的双突变体或多突变体，可进一步抑制气孔生理状态，从而进一 步改变植物对环境的适应性，例如更显著改善植物抗旱节水性。可利用其它的表型变化来筛选突变体植株或转基因植物，例如phyB基因功能丧 失或降低导致的红光下下胚轴明显伸长、真叶叶绿素含量变少、成熟植株开花时间提前等 变化；cryl基因功能丧失或降低导致中等或者是强蓝光条件下下胚轴明显伸长、花色素苷 积累水平下降；cry2基因功能丧失或降低导致弱蓝光下下胚轴明显伸长、成熟植株开花时 间延迟；PhyA基因功能丧失或降低导致红光下下胚轴明显伸长、真叶叶绿素含量变少、成 熟植株开花时间提前。
本发明可采用各种方法来使CRY1、CRY2、PHYA和PHYB基因功能丧失、降低或提高。这些方法包括采用物理诱变法(如使用快中子、Y射线)、化学诱变法(如使用EMS、甲基 磺酸乙酯)、T-DNA或转座子插入的方法。例如，在本发明的一个优选实施方式中，通过敲除 phyB、或其它光受体基因(例如cryl、cry2、phyA等)而实现所述功能的丧失。在本发明方法中，可采用如下方法获得二突变体或多突变体首先，获得phyB基 因突变、cryl基因突变、cry2基因突变或phyA基因突变的突变植株；然后，使所述突变植 株杂交，通过选择获得二突变体、三突变体或多突变体，例如crylphyB、cryl cry 2phyB或 cryIphyAphyB突变体植株。也可以利用CRYl、CRY2、PHYA和PHYB基因的cDNA序列，构建RNAi的表达载体，导 入植物获得转基因植株。分别筛选在蓝光条件下、远红光条件下和红光条件下下胚轴伸长 的转基因植株，即可获得CRY1、CRY2、PHYA和PHYB功能丧失或降低的植株。使突变种子在红光下发芽，筛选下胚轴明显变长的植株。移栽到土壤中，筛选在长 日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)开花时间明显提前以及叶子发黄的植株，通过PCR 来分析PHYB基因序列，即可获得phyB功能丧失或者降低的突变体。使突变种子在蓝光下发 芽，筛选下胚轴明显变长的植株。然后，将该下胚轴较长的植株移栽到土壤中，通过PCR来 筛选CRYl基因序列，即可获得CRYl功能丧失或者降低的突变体。使突变种子在弱蓝光下 发芽，筛选下胚轴明显变长的植株。然后将该下胚轴较长的植株移栽到土壤中，筛选在长日 照条件下(16小时光照/8小时黑暗)开花时间明显延迟的植株，通过PCR来分析CRY2基 因序列，即可获得CRY2功能丧失或者降低的突变体。使突变种子在远红光下发芽，筛选下 胚轴明显变长的植株。通过PCR来分析PHYA基因序列，即可获得phyA功能丧失或者降低 的突变体。也可以利用CRYl、CRY2、PHYA、PHYB基因的cDNA序列，构建RNA干扰或过表达的
植物表达载体，导入植物获得转基因植株。phyB最容易识别的功能包括在红光下抑制下胚轴的伸长、叶绿素含量减少和抑制 开花[Reed，J.W.等(1994). Plant Physiol 104，1139-1149. ]。CRYl 最容易识别的功能 包括在中等或强蓝光下(10-30μπιΟ1 ·πΓ2 · s-1)抑制下胚轴的伸长、促进花色素苷的积累 [Ahmad，M 等，(1993)Nature 366 162-166 ；Ahmad, Μ.等，(1995). Plant J. 8 653-658]； CRY2最容易识别的功能包括在弱蓝光下(l-5ym0l ·πΓ2 · s-1)抑制下胚轴的伸长[Lin, C.等，(1998). Proc Natl Acad Sci U S A 95，2686-2690.]和促进开花[Guo，H.等(1998). Science 279,1360-1363. ] ；phyA最容易识别的功能是在远红光下抑制下胚轴的伸长 [Whitelam GC等，(1993) Plant Cell 5 (7)，757-768.]。根据上述功能，对于所获得的表达 CRY或phyB的RNAi的转基因植株在中等或者是强蓝光条件下筛选得到的下胚轴明显伸 长、花色素苷积累水平下降的植株，即为CRYl功能丧失或降低的转基因植株；在弱蓝光下 筛选得到的下胚轴明显伸长，且在土壤中长成的成熟植株开花时间明显推迟的的转基因植 株，即为CRY2功能丧失或降低的转基因植株；在红光下筛选得到的下胚轴明显伸长，且在 土壤中长成的成熟植株开花时间明显提前及叶片的叶绿素的含量减少的转基因植株，即为 PhyB功能丧失或降低的转基因植株。本发明使CRY或PHYB基因功能丧失或者降低的方法并不限于上述方法，任何能使 CRY或PHYB基因功能丧失或者降低的方法都可以用于实施本发明的技术方案。
突变体植物或转基因植物本发明还涉及与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生改变的植物，所述中 PhyB基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能发生变化。在本发明的优选实施方式中， 所述植物是转基因植物或突变体。在一个优选实施方式中，所述方法还包括使所述植物与其它正常植物、突变体或 转基因植物杂交，从而获得与气孔生理状态相关的植物行为或表型发生改变的杂交后代， 优选所述杂交后代具有稳定的遗传性状。杂交用的植物在分类上属于同一科或不同科植 物，优选为同一科植物。所述植物优选为十字花科芸苔属、茄科番茄属、茄科烟草属、蝶形花 科、禾本科稻属或禾本科大麦属，更优选拟南芥菜、番茄、烟草、豌豆、水稻或大麦。所述植物还优选包含选自cryl、cry2和/或phyA基因或其编码的蛋白质或多肽 的表达或功能的改变。在一个优选实施方式中，所述植物为PhyB功能丧失或降低突变的双 突变体或多突变体，其可更显著地抑制气孔生理状态，从而进一步改善植物对环境的适应 性，例如更显著改善植物抗旱节水性。本发明的突变体植物或转基因植物具有改善的环境适应性能，可用于例如在干旱 或湿涝条件下生产农作物、经济作物或其产品。本发明的优点本发明的主要优点在于(1)提供了普遍存在于高等植物中的phyB基因及其编码的蛋白质或多肽的新用 途，其可通过改变植物气孔生理状态来有效改善植物的相关行为或表型，例如抗旱节水性、 生长速度、产品保鲜等；(2)提供了具有改善性状、抗性或适应性的转基因植物，为粮、棉、油等生产和加工 提供了优良原料和产品；(3)提供了改善植物性状、抗性或适应性的新途径，因而具有巨大应用前景。实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如 〈〈分子克隆实验手册〉〉(Molecular cloning :A laboratory manual, 3 rd ed. , Sambrook 等， Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)和《植物分子生物学实验手册》(Plant Molecular Biology-Α Laboratory Manual, Clark φ, Springer-Verlag, 1997)中的K牛，JM 制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有 专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均 等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1 :crylcry2phyB三突变体的构建用化学或物理诱变双子叶植物种子，创制突变体库(参考上文所列关于cryl、 cry2和phyB基因的文献)。用M2代种子分别在强蓝光、弱蓝光、红光和远红光下筛选下胚轴高的小苗。将在 弱蓝光下获得的下胚轴变高的突变体移栽到土壤中，选择开花时间延迟的突变体。将在红 光下获得的下胚轴变高的突变体移栽到土壤中，选择开花时间提前的突变体。
用PCR方法分别扩增以上突变体的CRYl、CRY2、PHYA、PHYB位点，并通过测序确定 突变位点，获得单突变体。当获得确定的Cryl、Cry2、phyA、phyB突变体后，可以先将cryl、 cry2突变体杂交，获得Fl代种子。在蓝光下对F2代进行筛选，选择下胚轴比cryl突变 体明显高的小苗，移栽到土里后选择开花时间延迟的植株与PhyB突变体杂交。从F3代中 筛选出在蓝光和红光下下胚轴都变高的突变体，并且通过PCR确定三个位点的突变，获得 cryl cry 2phyB纯合三突变体。其它双突变体、三突变体构建参考此方法。实施例2 过量表汰CRY1、CRY2和DhyB转基因棺株的构津通过PCR方法分别获得CRY1、CRY2和PHYB的全长cDNA(分别为SEQ IDNOs :1、3 和5)，分别插入pKY71载体或PHB载体的35S启动子下游，获得分别过量表达CRY1、CRY2和 PhyB的植物表达载体。再用这些载体分别转化植物，获得转基因植株。分别在中等强度蓝 光(20 μ mol · m_2 · s-1)、弱蓝光(1-5 μ mol · m_2 · s-1)和红光的条件下筛选下胚轴明显变短 的小苗，获得的转基因植株分别为过量表达CRY1、CRY2和phyB的转基因植株。实施例3 气孔密度和开度的研究光源及仪器测量气孔系数时所用的光源是LED屏，蓝光的波长为469纳米，红光的波长是680 纳米，远红光的波长为730纳米。在连续光照条件下的温度是22°C。光强测定用的仪器是 美国Li-Cor公司的Li250光量子测定仪和ILT1400-A光度计(ILT，MA, USA)。失水实骑取培养了 21天的WT (野生型)、phyB、crylcry2、cryl cry 2phyB拟南芥植株的离 体莲座叶片，放在22°C、连续ΗΟμπιοΙ ·πΓ2 · s—1的白炽荧光灯照射的条件下，测量其水分 损失，以最初新鲜叶子的重量百分比表示(按Leung, J.，Merlot，S. & Giraudat, J. (1997) Plant cell 9，759-771所述)。相对湿度维持为45%。气孔导度的测量将生长了约21天左右的WT (野生型)、phyB、crylcry2、cryl cry 2phyB植株转移 到250 μ mol ·πΓ2 · s—1的白炽荧光灯照射条件下，光照一小时后每种植物材料选取10-12片 完全伸展的叶子，利用气体交换测量系统LI-6400(LI-C0R Inc. Lincoln,NE,USA)测定气孔 导度。在测定的过程中，将CO2的浓度保持在390 μ mol · mol—1，将温度维持在22°C。气孔开度测量在测量气孔开度以前，先将生长至3-4周的植株置于黑暗下处理72小时，使所有 气孔关闭。在微弱的红光下撕取叶片表皮，置于2ml反应液(5mM MES，上海生工，货号为 ME169)，pH6. 5，50mM KC1，0. ImM CaC12)中，然后在相应光照条件(在每个具体的实验中具 体指明)下处理3小时。接着用显微镜(NikonECLIPSE TS100)观察，并用软件(Image J) 测量气孔的开度。气孔的照片是用激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM-510 ΜΕΤΑ)所拍摄 的。所有的测量工作在9:00到15:00之间完成。气孔密度和气孔系数的测量气孔密度定义为单位面积上的气孔数目。气孔系数(Si)用公式表示为SI =气 孔个数/ (气孔个数+表皮细胞的个数)X100。取生长在混合光(蓝光30 μ mol · πΓ2 · s"1+红光50 μ mol · πΓ2 · s"1+远红光 6 μ mol · πΓ2 · 下的 WT、crylcry2、phyAphyB 和 crylphyAphyB 的植株的真叶，放在酒精中浸泡约4小时，用一系列酒精梯度(90%—75%—50%—25% )复水，然后放在透明液 (甘油水合氯醛水=1 8 1，(V W V))中过夜。样品置于LeiCaDM2500显微 镜下，每片真叶随机选取5个区域拍照。统计约5片真叶，得到平均值和标准差。试验结果及讨论(1)拟南芥三突变体CrylCry2phyB失水速率最慢，气孔导度最小通过用WT、phyB, crylcry2、crylcry2phyB植株的离体莲座叶片进行的失水实验 的结果如图IA所示。研究表明最不容易失水的植株为CrylCry2phyB三突变植株；phyB 单突变植株的失水率低于野生型植株；而CrylCry2双突变体植株的失水率则低于phyB 单突变植株。即，失水率从高至低为WT — phyB单突变植株一crylcry2双突变体植株 —crylcry2phyB三突变植株。气孔导度实验的结果如图IB所示，其结果与失水实验的结果相一致。气孔导度的 测定试验表明CrylCry2phyB三突变植株的气孔导度最小，与气孔导度最大的WT野生型植 株相比，具有极显著的差异(**P<0.01) ；phyB单突变和crylcry2双突变体的植株的气 孔导度居于其间，与WT植株相比，具有显著差异(*P<0.05)。即，气孔导度从大到小为 WT — phyB单突变植株一crylcry2双突变体植株一crylcry2phyB三突变植株。(2)拟南芥phyB单突变体的气孔开度比野生型的小，phyB过量表达导致气孔开度 显著增加WT,phyB和phyB_ovx (将由35S强启动子启动的PHYB cDNA序列构建到一个植物 表达载体中，将这个载体转入植物中，挑选具有过表达表型的单株)黑暗处理后红光诱导 的气孔开度实验结果如图2所示。柱状图所示为至少50个气孔开度的统计值，以平均值士 标准差表示。结果显示phyB单突变体的气孔开度明显变小，phyB-ovx气孔开度显著增加 (*P < 0. 05，**P < 0· 01，t 检验)。白光下的结果与红光诱导的结果类似。(3)拟南芥三突变体CrylCry2phyB的气孔开度最小对见光发芽生长约四周(其中在MS培养基上培养一周后，种植到土壤中三周)的 植株在白光下进行气孔开度的观察结果和统计结果分别如图3A和图3B所示。结果显示phyB单突变和crylcry2双突变的气孔开度均显著小于野生型(*，P < 0. 05)，而crylcry2phyB三突变体的气孔开度比phyB单突变和crylcry2双突变的气孔 开度还要小，与野生型具有极显著差异(**，P < 0. 01)。上述结果表明CRY和phyB共同参与了白光诱导的气孔开放。(4)拟南芥三突变体crylphyAphyB的气孔开度小于单突变体和双突变体对生长 约四周的植株在白光下进行气孔开度的统计结果如图4所示。结果显示单突变体的气孔开度均有所减小，其中phyB的气孔开度显著小于 野生型(*P < 0. 05) ；phyAphyB双突变体的气孔开度比phyB单突变的气孔开度更小； crylphyAphyB三突变体的气孔开度与野生型相比，具有极显著差异(**，P < 0. 01)。上述结果表明CRY、phyA和phyB共同参与了白光诱导的气孔开放。(5) CRY1、CRY2、PHYA和PHYB都参与调节气孔系数气孔密度的观察和气孔系数的统计结果分别如图5A和图5B所示。生长在混合光(蓝光30 μ mol · m_2 · s—1+红光50 μ mol · m_2 · s—1+远红光6 μ mol · 2 · S-1)下的拟南芥crylcry2、phyAphyB和crylphyAphyB突变株的莲座叶的气 孔系数均极显著低于野生型(**，P < 0. 01), crylphyAphyB的气孔系数最低，甚至极显著低 于phyAphyB (图中以WT为基准)。研究显示突变体的气孔系数低于野生型，而野生型中这些基因是正常起作用的， 说明这些基因的功能是提高气孔系数。(6) CRYl、CRY2、PHYA和PHYB都可以提高气孔密度如表1中所列的气孔密度的数据，其中CRY1-0X、CRY2-0X和PHYB-OX分别表示过 表达CRY1、CRY2和PHYB的植株。结果显示增加CRY1、CRY2和PHYB的表达量都可以导致气孔密度的极显著增加； 而phyB缺失，则导致气孔密度极显著降低，而这几个基因的其它多突变体也表现出气孔密 度降低的表型。表权利要求
1.植物PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽在调节植物与气孔生理状态相关的环境适 应性表型或行为中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述气孔生理状态为选自下组中的一种或 多种气孔开度、气孔密度、气孔导度或气孔系数。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物与气孔生理状态相关的环境适应 性表型或行为为选自下组中的一种或多种叶片失水、水分蒸腾速率、光合作用效率、抗旱 节水性、抗涝适水性或新鲜度保持。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽的 减少或功能的丧失或降低，对正常植物气孔生理状态产生抑制作用；所述PhyB基因或其编 码的蛋白质或多肽的增加或功能的增强，对正常植物气孔生理状态产生促进作用。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物还同时具有cryl、Cry2和/或phyA 基因或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能的改变。
6.植物PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽在调节植物气孔生理状态中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物还同时具有Cryl、Cry2和/或phyA 基因或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能的改变。
8.—种产生与气孔生理状态相关的环境适应性表型或行为发生改变的植物的方法，所 述方法包括改变所述植物中PhyB基因或其编码的蛋白质或多肽的数量或功能。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包含改变选自Cryl、Cry2和/或 PhyA基因或其编码的蛋白质或多肽的表达或功能。
10.用权利要求8-9中任一项所述的方法制备的植物的用途，其用于在干旱或湿涝条 件下生产农作物、经济作物或其产品。
全文摘要
本发明提供了一种改变植物气孔密度和开度的方法，所述方法包括调节植物中PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽，或调节其与CRY1、CRY2和/或PHYA基因或其编码的蛋白质或多肽的组合。本发明涉及植物PHYB基因或其编码的蛋白质或多肽在调节植物与气孔生理状态中的用途，及其在调节植物与气孔生理状态相关的环境适应性表型或行为中的用途。本发明的方法可用于调节叶片失水、水分蒸腾速率、光合作用效率、改善植物抗旱节水性或抗涝适水性、或延长保鲜时间等，具有一定的经济意义。
文档编号C12N15/82GK101993889SQ20091019463
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者康春颖, 杨洪全, 王芳芳 申请人:中国科学院上海生命科学研究院