Bsmv-vigs重组载体及其在小麦产量性状基因研究中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于农业应用生物技术领域，尤其设及一种BSMV-VIGS重组载体及其在小 麦产量性状基因研究中的应用。
【背景技术】
[0002] 病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统是近年来发 展起来研究基因功能的新方法，它的原理主要是：当携带目标基因 cDNA的病毒载体浸染植 物细胞后，在植物细胞内复制与表达过程中会形成双链RNA形式的中间体(dsRNA)，dsRNA作 为基因沉默的激发子，首先在细胞中被特异核酸内切酶切割成小片段的RNA(siRNA)，然后 siRNA在植物细胞内被RNA聚合酶进一步扩增，并W单链形式与一些特异蛋白（AG01)等结合 形成RNA诱导的沉默复合体，此沉默复合体又特异与胞质中同源RNA互作，造成同源RNA降解 导致产生转录后水平的基因沉默。
[0003] 小麦是世界上Ξ大重要粮食作物之一，其中普通小麦(Triticum aestivum L.)产 量占全世界小麦总产90% W上。普通小麦是异源六倍体，含有A、B和DS套染色体组，95% W上 的基因存在3个或更多拷贝，其基因组非常庞大（17000Mb，分别是水稻和玉米基因组的40倍 和7倍），而且结构复杂(85%W上序列为重复序列）；同时，由于小麦基因型的依赖性很强、品 种间再生能力差异显著，导致稳定的再生体系尚未建立，成为现今世界上最难转化的作物 之一。运些主要因素导致了现今小麦分子机理的研究远落后于基因组较小、转化相对容易 的水稻等其它主要农作物。虽然已有一些小麦抗逆基因在拟南芥、烟草和水稻等转化较为 容易的植物上进行了功能验证，但对于控制小麦巧粒淀粉、蛋白质等产量性状基因来说，由 于物种间产量性状及生长环境的差异性(水稻等属于喜溫的秋粮作物，生长在溫度较高的 夏季;而小麦属于喜凉的越冬作物，大部分时间生长在溫度较低的冬季与春季），小麦产量 性状基因的功能不适宜在水稻等基因组简单、转化容易的作物上进行。因此，摸索出一种适 合研究小麦产量性状基因功能的研究方法，有助于深入掲示小麦产量性状形成的分子机 理。
[0004] VIGS方法克服了遗传转化困难植物基因功能研究方法的局限性，主要有W下优 点：（1)VIGS能直接在个体中鉴定基因功能缺失的表型，无需通过耗费较长的时间筛选大量 再生植株个体来鉴定转基因植株，可快速鉴定基因功能；（2)它是一种瞬时基因沉默方法， 不需要复杂的遗传转化体系；（3)能通过对基因家族中高度保守的序列进行沉默来克服基 因功能冗余现象；（4)可快速比较同一基因在不同物种中的功能，W进行比较基因组学研 究。上述优点对于遗传转化困难、且基因组庞大而复杂的普通小麦来说，非常适用，因此， VIGS已在小麦基因功能研究上开始应用。
[0005] 但现今国内外运用VIGS方法研究小麦基因的功能均在实验室培养箱内或溫室内 等易控条件下（人工可设定的溫度、湿度、光照等可控的生长条件)进行小麦抗逆基因的功 能研究。但培养箱或溫室可控条件下与田间多变条件下的小麦植株的生长状况有一定差 异。如培养箱或溫室中小麦植株生长发育表现出分葉率较差、生育期缩短、生育后期植株早 衰、千粒重较低、产量显著低于田间生长的小麦植株等现象，导致在培养箱或溫室环境下利 用VIGS方法研究小麦基因功能、特别是产量性状基因的功能有一定局限性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种BSMV-VIGS重组载体，利用该载体可在田间自然条件 下，建立一种研究小麦产量性状基因功能的有效方法，有利于深入掲示小麦产量性状基因 功能的分子机制，W指导小麦的育种工作。
[0007] 本发明的研究思路为：利用大麦条纹花叶病毒（barley shipe mosaic virus, BSMV)重组构建含有α、β和丫 S条不同的单链RNA的BSMV载体系统(如图1所示）。分别将 上述Ξ条链的RNA反转录合成cDNA后，克隆到对应的pBSMV载体上。该载体包含有T7启动子 和转录原点，可通过T7 RNA聚合酶W线性化BSMV载体为模板体外进行转录，获得病毒 RNA，用转录得到的3条链的RNA转录本等量摩擦接种植物后，病毒RNA在植物体内能形成 具有活性的基因组，进行增殖传播。在丫 b之后有一个Nhel酶切位点，可将目标基因片段通 过分子克隆构建到BSMV-丫载体上，目标基因片段可W随着病毒自身基因组的复制而得到 复制，并通过转录后水平沉默目标基因。
[0008] 为完成上述目的，本发明采用W下技术方案来实现的： 构建了一种BSMV-丫：TaRSRl重组载体，其为含有目标基因片段、隧菌体η ori、抑制 因子laci、大肠杆菌El因子o;ri、0-内酷胺酶基因 bla、T7启动子的病毒RNA，所述目标基因片 段为沈Q ID N0.1所示的化RSR1转录因子mRNA部分cDNA序列。
[0009] 上述重组载体的制备方法，包括W下步骤： (1)化RSR1转录因子mRNA部分cDNA片段的克隆 提取小麦巧粒的总RNA，并通过反转录获得与小麦总RNA对应的cDNA，取所得cDNA作为 模板，通过PCR扩增化RSR1转录因子片段序列，用所得扩增产物进行电泳检测、切胶回收，将 回收所得扩增产物连接至PMD18-T simple载体，再转化大肠杆菌D册α，然后，挑取验证过的 阳性单克隆，进行测序鉴定； (2化SMV- 丫： TaRSRl重组载体的构建、转化与筛选 取测序正确的化RSR1-PMD18-T simple质粒与BSMV-丫： GFP质粒分别用限制性内切酶 Nhe I单酶切，再进行电泳检测、切胶回收，分别得到纯化的TaRSRl基因片段和BSMV-丫质 粒； 用T4-DNA连接酶将纯化后的化RSR1基因片段连接至纯化后的BSMV-丫质粒，得到BSMV-丫：化RSR1重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌JM109,涂布在LB平板培养基上，LB平 板培养基经37°C过夜培养长出单菌落，将所得单菌落依次进行PC閲金证、重组质粒酶切验证 和测序鉴定，挑选阳性菌落，得BSMV-丫：化RSR1重组载体。
[0010] 由等体积的 BSMV-cuBSMV-β、及上述 BSMV-丫： TaRSRl,加入 DEPC water 和 2XGKP buffer等混合均匀后，制成各载体浓度为500 pg/ml的病毒接种混合液，可用小麦产量性状 基因功能的研究，用于指导小麦育种工作，也可直接将其用于小麦增产。
[0011] 上述病毒接种混合液的制备方法，包括W下步骤： (DBSMV载体线性化 用限制性内切酶Mlu I分别单酶切BSMV-a质粒和权利要求2所得BSMV-丫：化RSR1重组 质粒，使其线性化;用限制性内切酶Spe I单酶切BSMV-β质粒，使其线性化； (2) 体外转录生产病毒 取所得线性化BSMV-cuBSMV-β和BSMV- 丫： TaRSRl载体DNA分别进行体外转录、检测和 保存； (3) 病毒接种混合液的制备 取等体积的 BSMV-a、BSMV-e、BSMV-丫： TaRSRl，与9倍于BSMV-a体积的DEPC water和 12倍于BSMV-a体积的2XGKP buffer混合均匀，即成。
[0012] 田间自然条件下研究小麦产量性状基因功能的方法，包括W下步骤： 于小麦抽穗期，在田间创造一个高湿(湿度85%W上）、黄昏弱光、18~22°C低溫的环境， 用上述BSMV-VIGS沉默载体病毒接种混合液摩擦小麦穗部进行接种;接种后，于小麦开花期 和灌浆期保持高湿环境（小麦植株用薄膜拱棚覆盖，处于相对封闭的空间，湿度达85%W 上）；同时，接种7天后对接种植株进行表型观察、目标基因的转录水平检测，成熟时进行产 量性状测定。
[0013] 本发明具有W下积极有益技术效果： 1.本发明重组载体实现了田间条件下小麦产量性状基因的沉默