水稻恢复系杂交后代产量性状一般配合力的快速鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及一种基于SSR分子标记技 术的水稻恢复系杂交后代产量性状一般配合力的快速鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 全世界以水稻为主粮的人口超过了一半。据统计，约90%的稻米是在亚洲生产和 消费的。稻米年均消费以1.5%的速度增产，但水稻产量的增长只有1 %，供需矛盾不断加 大。上世纪70年代，我国杂交水稻研制成功打破了水稻产量停滞不前的局面，是继矮化育种 之后水稻育种领域的第二次重大突破。
[0003] 杂交水稻育种的难度在于，选育好的杂交水稻组合，首先要选育好的亲本。一般配 合力是杂交水稻亲本选配最重要的指标。一般配合力选配的传统做法是，用多个目标亲本 与不同来源的材料进行人工双列杂交，连续多年配制大量的F1杂交组合，在不同地点不同 年份与对照组合进行产量等性状的杂种优势表型鉴定，计算相关亲本的一般配合力(Verma 0.P.,Srivastava Η.K.Genetic component and combining ability analyses in relation to heterosis for yield and associated traits using three diverse rice-growing ecosystems.Field Crops Research 2004,88:91-102；Haddadi Μ.H., Eesmaeilof M.,Choukan R.,Rameeh V. Combining ability analysis of days to silking,plant height,yield components and kernel yield in maize breeding lines .African Journal of Agricultural Research 2012,7(36) :5153-5159) 〇米用该方 法，往往需要投入大量的人力物力，鉴定结果又容易受环境条件的影响，而且往往需要多年 的连续鉴定，花费的时间长，效率低。利用分子标记技术辅助进行一般配合力的鉴定是杂交 水稻育种的重要方向。但是，一般配合力遗传基础复杂，加上缺乏适合的定位群体，分子标 记定位难度大，结果一致性差，开发与一般配合力紧密连锁的分子标记难度较大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于SSR分子标记技术的水稻恢复系杂交后代产量性状 一般配合力的快速鉴定方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供与水稻恢复系产量性状一般配合力紧密连 锁的SSR分子标记，所述SSR分子标记为RM508和RM587，两个SSR分子标记位于水稻第6号染 色体上；
[0006] 用于PCR扩增标记RM508的引物对I为：
[0007] 正向引物：5' -GGATAGATCATGTGTGGGGG-3'
[0008] 反向引物:5' -ACCCGTGAACCACAAAGAAC-3'
[0009] 扩增产物中含有重复基序：（AG)17;退火温度:55°C;扩增产物大小:235bp。
[0010] 用于PCR扩增标记RM587的引物对II为：
[0011] 正向引物：5' -ACGCGAACAAATTAACAGCC-3'
[0012] 反向引物：5' -CTTTGCTACCAGTAGATCCAGC-3'
[0013] 扩增产物中含有重复基序：（CTT)18;退火温度:55°C;扩增产物大小:217bp。
[0014] 本发明还提供水稻恢复系杂交后代(特别是水稻骨干恢复系蜀恢527改良后代)产 量性状一般配合力的快速鉴定方法，包括如下步骤：
[0015] 1)提取待测水稻的基因组DNA;
[0016] 2)以待测水稻的基因组DNA为模板，利用扩增所述SSR分子标记RM508和RM587的引 物对I和/或引物对Π ，进行PCR扩增反应；
[0017] 3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物具有与蜀恢527相同的特征条带，则判定待测 水稻具备高一般配合力，如果扩增产物具有与蜀恢527不同的带型，则判定待测水稻不具备 高一般配合力。
[0018] 前述的方法，步骤1)中采用CTAB法提取水稻的基因组DNA，在苗期，每个株系混取 10株叶片用于DNA提取。
[0019] 前述的方法，步骤2)中PCR反应体系如下:DNA模板5μ1，dNTP2yl，TB缓冲液2μ1，正、 反向引物各2μ1，Taq DNA聚合酶0.5μ1，ddH20补足至20μ1;反应程序如下：95°C预变性5min; 95°C 变性 45s，55°C_67°C 退火 45s，72°C 延伸 lmin，35 个循环;72°C 延伸 lOmin; 4°C 保存。
[0020] 前述的方法，步骤3)中用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。用已 配好的genefinder染色液染色，然后用柯达凝胶成像系统进行照像、读胶。具体步骤如下： (1)清洗玻璃板:两块玻璃板先用蒸馏水冲洗3遍后晾干，再用75%的酒精用擦镜纸擦洗2 遍，晾干。（2)装板灌胶:将清洗干净的玻璃板用夹子固定好，然后配制聚丙烯酰胺凝胶，配 好后快速灌入玻璃板中，避免气泡出现，然后插上梳子，室温放置10分钟以上。（3)架板点 样:将已经凝固的胶板放置于含有缓冲液（1 X TAE)的电泳槽中，用夹子固定，在上槽缓慢灌 入缓冲液（1XTAE)至没过胶面后拔掉梳子;将水循环仪调至15~20°C左右，然后拔掉梳子， 防止破坏点样孔，用移液器点样，每个样品2μ1，点样完毕后开始电泳，根据扩增产物片段大 小运行1.5~2小时。（4)染色：电泳完毕后，关闭电源，将胶板从电泳槽中取下，将胶取出，置 于已配好的genefinder染色液的盒子里，避光染色15分钟。然后用柯达凝胶成像系统进行 照像、读胶。
[0021] 对于标记RM508和/或RM587,带有蜀恢527等位基因带型的，认定为具备高一般配 合力染色体片段，相应的后代单株或株系保留；带有与蜀恢527等位基因条带不同带型的， 认定为不具备高一般配合力染色体片段，相应的后代单株或株系淘汰。
[0022] 本发明涉及的水稻恢复系杂交后代的构建方法如下：以水稻恢复系蜀恢527作为 轮回亲本，选择用于改良轮回亲本的优良供体亲本;利用轮回亲本与供体亲本杂交并与轮 回亲本回交，获得高代回交群体;对高代回交群体进行产量性状初步筛选，获得产量选择导 入系;利用产量选择导入系与生产上广泛使用的不育系杂交，获得杂交种群体，即得。进一 步地，对杂交种群体进行产量相关性状的考察，用于测定一般配合力测定和对分子标记鉴 定结果的验证。
[0023]利用培育的试验群体定位恢复系产量性状的一般配合力，发现RM508及RM587是与 蜀恢527产量性状一般配合力紧密连锁连锁的分子标记，因此选作鉴定标记，对导入系或后 续恢复系与蜀恢527,以及与蜀恢527配组的其他亲本进行标记基因型分析。在今后育种工 作中，可直接使用该标记进行一般配合力鉴定，不必再配置大量组合进行配合力的表型测 定。
[0024] 本发明进一步提供所述SSR分子标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。
[0025] 本发明是利用分子标记技术快速鉴定水稻恢复系杂交后代，特别是水稻骨干恢复 系蜀恢527改良后代一般配合力的方法。利用与骨干恢复系蜀恢527高一般配合力紧密连锁 的双侧分子标记，对蜀恢527回交导入后代进行分子标记基因型检测，就可以快速、准确、高 效地选出具备高一般配合力的单株。该方法操作简便、不受环境条件的影响，因此可以达到 降低育种成本、加速育种进程、缩短育种年限，进而提高育种效率，具有广阔的应用前景。 [0026]本发明具有以下优点：
[0027](一)精度高:实验室分子标记鉴定操作已经标准化，SSR鉴定结果精确可靠。
[0028](二)速度快:一个熟练操作者一天内至少可以鉴定300份材料。而田间杂交的方式 鉴定300份材料则至少要两个季节，需要耗费一年多时间进行杂交配组和后代表型鉴定。 [0029](三）成本低：按照300份材料的SSR标记成本，加上人工成本，最多花费500元。而 300份材料的人工杂交和后代鉴定，至少花费1万元以上。
[0030] (四）不受环境和其他不可控因素条件影响:实验室SSR标记能标准化操作，试验条 件完全可控。避免了田间杂交和后代鉴定容易受到不同的气候、天气、土壤肥力、栽培管理 水平、杂交工人的技术水平、后代鉴定的可靠性等因素的影响。
【附图说明】
[0031] 图1表示本发明实施例1中轮回亲本蜀恢527(SH)与供体亲本ZDZ057(ZDZ)和特青 (TQ)的RM508与RM587标记位点的带型差异。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0033]以下实施例中涉及的PCR法参照郑景生等(2003)公开的方法并略作改动。SSR引物 由上海生物工程公司合成。PCR仪为MJ PTC-100。
[0034]实施例1基于SSR分子标记技术的水稻恢复系杂交后代产量性状一般配合力的快 速鉴定方法
[0035 ] 1、水稻骨干恢复系蜀恢527改良后代的获得
[0036]骨干恢复系的选择:选择一般配合力强、在生产上大面积推广应用的水稻骨干恢 复系蜀恢527为轮回亲本。
[0037]供体亲本的选择：以优良水稻恢复系ZDZ057和常规稻品种特青TQ。
[0038]目标群体的培育：以蜀恢527分别与ZDZ057和特青进行杂交，再以蜀恢527进行两 次回交，使得后代个体的遗传背景与蜀恢527基本相似。通过产量性状选择，分别从蜀恢 527/ZDZ057//蜀恢527和蜀恢527/特青//蜀恢527的BC2F2群体筛选出32个和25个产量选择 导入系，作为配合力测定的恢复系群体。
[0039] 2、多态性分子标记筛选:在苗期，对每个株系混取10株叶片用于DNA提取。DNA提取 方法采用CTAB法。约650对SSR(simple sequence repeat)标记分别用于亲本间多态性筛 选。最终，蜀恢527/ZDZ057群体获得了 128个多态性标记，蜀恢527/特青群体获得了 144个多 态性标记。对这些多态性标记进行筛选，去掉位置重复和物理距离较小的标记，最终2个群