包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合 ...的制作方法
【专利说明】包含特异于靶DNA的向导RNA和CAS蛋白质编码核酸或CAS蛋白 质的用于切割靶DNA的组合物及其用途
[00011本申请是申请日为2013年10月23日的、发明名称为"包含特异于靶DNA的向导RNA 和CAS蛋白质编码核酸或CAS蛋白质的用于切割靶DNA的组合物及其用途"的中国专利申请 201380066348.4(PCT/KR2013/009488)的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地说，本发明涉及一 种用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途，所述组合物包括特异于靶DNA 的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
【背景技术】
[0003] CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列）是含有多个短同向重复的基因座，其 被发现存在于约40%测序细菌的基因组中和90%测序古细菌的基因组中。CRISPR作为原核 的免疫系统发挥功能，其赋予对外来遗传元件例如质粒和噬菌体的抵抗性。CRISPR系统提 供了一种获得性免疫形式。外源DNA的短片段(称为间隔区）整合在CRISPR重复序列之间的 基因组中，作为过去暴露的记忆。然后CRISPR间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于 识别和沉默外来遗传元件。
[0004] Cas9，II型CRISPR/Cas系统中一种重要的蛋白质成分，当与称为CRISPR RNA (crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的两个RNA复合时，形成活性核酸内切酶，从而切断入 侵噬菌体或质粒中的外源遗传元件，以保护宿主细胞。crRNA从宿主基因组中的CRI SPR元件 转录，其中该CRISPR元件之前自外源入侵物捕获。最近，Jinek等（1)证明，通过融合crRNA和 tracrRNA的必要部分产生的单链嵌合RNA可以取代Cas9/RNA复合体中的两个RNA以形成功 能性核酸内切酶。
[0005] CRISPR/Cas系统相对于锌指和转录激活因子样效应物DNA结合蛋白提供了优 势--因为在核苷酸结合CRISPR-Cas蛋白中的位点特异性由RNA分子调控而不是DNA结合 蛋白调控(这在设计和合成上是更具挑战性的）。
[0006] 然而，到现在为止，尚未开发出使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶 (RGEN)的基因组编辑方法。
[0007] 同时，限制性片段长度多态性(RFLP)是最古老，最方便，和最便宜的基因分型方法 之一，其仍然广泛应用于分子生物学和遗传学，但其往往受限于缺乏适当的限制性内切酶 识别位点。
[0008] 可以通过各种方法检测由工程化核酸酶诱导的突变，其中包括错配敏感的T7核酸 内切酶I (T7E1)或Surveyor核酸酶测定法，RFLP，荧光PCR产物的毛细管电泳，双脱氧测序和 深度测序。T7E1和Surveyor测定法广泛使用，但很繁琐。此外，这些酶倾向于低估突变频率， 这是因为突变序列可彼此形成同源双链，从而不能从野生型细胞中区分纯合双等位基因突 变体克隆。RFLP没有这些限制，因而是首选的方法。实际上，RFLP是检测细胞和动物中由工 程化核酸酶介导的突变的最早方法之一。然而，不幸的是，RFLP受限于适当限制性位点的可 得性。在所关注的靶位点有可能没有限制性位点。
【发明内容】
[0009] 技术问题
[0010] 到现在为止，尚未开发使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)进 行基因组编辑和基因分型的方法。
[0011] 在这种情况下，本发明人进行了大量努力来开发基于CRISPR/Cas系统的基因组编 辑方法，最终建立了一个可程序化的RNA向导核酸内切酶，该RNA向导核酸内切酶可以在真 核细胞和生物体中以靶向方式切割DNA。
[0012]另外，本发明人进行了大量努力，开发一种新的在RFLP分析中利用RNA向导核酸内 切酶(RGEN)的方法。其利用RGEN，对癌症中发现的以及细胞和生物体中由工程化核酸酶(包 括RGEN自身)诱导的频发突变进行基因分型，从而完成了本发明。
[0013] 技术方案
[0014] 本发明的一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，其包 括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的组合物， 其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的试剂盒，其 包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的试剂盒， 其包括特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0018] 本发明的再一目的是提供一种制备含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物 体的方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质以及向导RNA或编码向导RNA的 DNA共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种真核细胞或生物体，其含有特异于靶DNA的向导 RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0020] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的方法，所述 方法包括步骤：用组合物转染含有靶DNA的真核细胞或生物体，所述组合物含有特异于靶 DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0021] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的方法，所 述方法包括步骤:用组合物处理真核细胞或生物体，其中所述组合物含有特异于靶DNA的向 导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0022] 本发明的再一个目的是提供胚胎、基因组修饰的动物或基因组修饰的植物，其包 括由组合物编辑的基因组，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和 Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0023] 本发明的另一个目的是提供一种制备基因组修饰的动物的方法，所述方法包括步 骤:将含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质 的组合物，引入动物胚胎中；和将胚胎转移到假孕代母的输卵管中，以产生基因组修饰的动 物。
[0024]本发明的另一个目的是提供一种组合物，其用于在分离的生物样品中基因分型突 变或变异，所述组合物包含特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
[0025]本发明的另一个目的是提供一种使用RNA向导核酸内切酶(RGEN)对细胞中由工程 化的核酸酶诱导的突变或天然存在的突变或变异进行基因分型的方法，其中所述RGEN包含 特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
[0026]本发明的另一个目的是提供对细胞中由工程化的核酸酶诱导的突变或天然存在 的突变或变异进行基因分型的试剂盒，所述试剂盒含有RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其中所 述RGEN含有特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
[0027] 本发明的一个目的是提供在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物，所述组合 物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0028] 本发明的另一个目的是提供在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的组合物，所述 组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白 质。
[0029] 本发明的另一个目的是提供在真核细胞或生物体中切割靶DNA的试剂盒，所述试 剂盒含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0030] 本发明的另一个目的是提供在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的试剂盒，所述 试剂盒含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白 质。
[0031] 本发明的另一目的是提供制备含有Cas蛋白质和向导RNA的真核细胞或生物体的 方法，所述方法包括用Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质以及向导RNA或编码向导RNA的DNA 共转染或顺序转染真核细胞或生物体的步骤。
[0032] 本发明的另一个目的是提供一种真核细胞或生物体，其含有特异于靶DNA的向导 RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0033] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中切割靶DNA的方法，所述 方法包括用组合物转染含有靶DNA的真核细胞或生物体的步骤，所述组合物含有特异于靶 DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0034] 本发明的另一个目的是提供一种在真核细胞或生物体中诱导靶向诱变的方法，所 述方法包括用组合物处理真核细胞或生物体的步骤，所述组合物含有特异于靶DNA的向导 RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0035] 本发明的另一个目的是提供胚胎、基因组修饰的动物、或基因组修饰的植物，其包 含由组合物编辑的基因组，所述组合物含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和 Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。
[0036] 本发明的另一个目的是提供一种制备基因组修饰的动物的方法，所述方法包括步 骤:将含有特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质 的组合物，引入动物胚胎中；和将胚胎转移到假孕代母的输卵管，以产生基因组修饰的动 物。
[0037] 本发明的另一个目的是提供在分离的生物样品中基因分型突变或变异的组合物， 所述组合物含有特异于革GDNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
[0038] 本发明的另一个目的是提供在分离的生物样品中对病原微生物的核酸序列进行 基因分型的组合物，所述组合物含有特异于靶DNA序列的向导RNA和Cas蛋白质。
[0039] 本发明的另一个目的是提供一种在分离的生物样品中基因分型突变或变异的试 剂盒，所述试剂盒含有组合物，特别地含有RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其中，所述RGEN包含 特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
[0040] 本发明的另一个目的是提供在分离的生物样品中基因分型突变或变异的方法，该 方法使用组合物，特别地所述组合物包含RNA向导核酸内切酶(RGEN)，其中，所述RGEN包含 特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质。
[0041 ] 有益效果
[0042]包含特异于革巴DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的用于在真核细 胞或生物体中切割靶DNA或诱导靶向诱变的本发明组合物、包含所述组合物的本发明试剂 盒、以及诱导靶向诱变的本发明方法，提供了新的方便的基因组编辑工具。另外，因为可以 设计定制RGEN以靶向任何DNA序列，所以几乎任何单核苷酸多态性或小的插入/缺失 (indel)均可以通过RGEN介导的RFLP进行分析，因此，本发明的组合物和方法可以用于检测 和切割天然存在的变异和突变。
[0043] 附图简述
[0044] 图1显示Cas9催化的体外质粒DNA切割。（a)靶DNA和嵌合RNA序列的示意图。红色三 角指示切割位点。Cas9识别的PAM序列以粗体显示。向导RNA中源自crRNA和tracrRNA的序列 分别以框和下划线显示。（b)Cas9体外切割质粒DNA。完整的环状质粒或ApaLI消化的质粒与 Cas9和向导RNA孵育。
[0045] 图2显示Cas9在附加体（episomal)靶位点诱导的诱变。（a)使用RFP-GFP报告分子 的基于细胞测定法的概略示意图。因为GFP序列在读框外融合至RFP序列，故GFP不从该报告 分子表达。只有当两个序列之间的靶位点被位点特异性核酸酶切割后，RFP-GFP融合蛋白才 表达。（b)转染了 Cas9的细胞的流式细胞术。显示表达RFP-GFP融合蛋白的细胞的百分比。 [0046] 图3显示在内源染色体位点上由RGEN驱动的突变。（a)CCR5基因座。（b)C4Bro基因 座。（顶部)使用T7E1测定法检测RGEN驱动的突变。箭头指示由T7E1切割的DNA条带的预期位 置。通过测量条带强度，计算突变频率(Inde 1 ( % ))。（底部)CCR5和C4BTO野生型(WT)和突变 克隆的DNA序列。互补于向导RNA的靶序列区域示于框中（in bochPAM序列以粗体显示。三 角形指示切割位点。对应于微同源性(microhomologies)的碱基加下划线。右手列显示插入 或缺失碱基的数目。
[0047] 图4显示不能检测到RGEN驱动的脱革E(off-target)突变。（a)标革E(On-target)序 列和潜在的脱靶序列。在硅片上搜索人类基因组，以寻找潜在的脱靶位点。鉴定了四个位 点，其中每个携带3个碱基的与CCR5标靶位点的错配。错配碱基加下划线。（b)使用T7E1测定 法调查这些位点是否在转染Cas9/RNA复合体的细胞中发生突变。在这些位点没有检测到突 变。N/A(不适用），基因间位点。（c)Cas9没有诱导脱靶相关的染色体缺失。在人细胞中表达 CCR5特异的RGEN和ZFN。使用PCR检测在这些细胞中15-kb染色体缺失的诱导。
[0048] 图5显示小鼠中RGEN诱导的Foxn 1基因打靶。（a)描绘了特异于小鼠 Foxn 1基因外显 子2的sgRNA的示意图。外显子2中的PAM表示为红色，sgRNA中互补于外显子2的序列加下划 线。三角形指示切割位点。（b)代表性的T7E1测定，表明通过胞质内注射而递送至一细胞阶 段的小鼠胚胎中的Cas9 mRNA+Foxnl特异性sgRNA的基因打靶效率。数字指示由最高剂量产 生的独立建立者小鼠。箭头指示由T7E1切割的条带。（c)b中鉴定的三个Foxnl突变建立者小 鼠中观察到的突变等位基因的DNA序列。发生数显示在括号中。（d)对Foxnl建立者小鼠#108 和野生型FVB/NTac杂交产生的F1后代进行的PCR基因分型。注意，存在于Foxnl建立者小鼠# 108中的突变等位基因在后代中分离。
[0049] 图6显示通过胞质内注射Cas9 mRNA和Foxnl-sgRNA在小鼠胚胎中的Foxnl基因打 靶。（a)代表性T7E1测定的结果，其监测注射最高剂量后的突变率。箭头指示由T7E1切割的 条带。(b)T7El检测结果总结。显示在胞质内注射所示剂量RGEN后获得的体外培养胚胎中的 突变体分数。（c)从T7E1阳性突变胚胎子集鉴定的Foxnl突变等位基因的DNA序列。野生型等 位基因的靶序列表示在框内。
[0050] 图7显示使用重组Cas9蛋白质:Foxnl-sgRNA复合体在小鼠胚胎中的Foxnl基因打 靶。（a)和(b)是代表性T7E1测定结果和其总结。胚胎进行原核(a)或胞质内注射(b)后体外 培养。红色数字表示T7E1阳性突变建立者小鼠。（c)从体外培养的胚胎鉴定的Foxnl突变等 位基因的DNA序列，该胚胎通过以最高剂量原核注射重组Cas9蛋白质:F 〇Xnl-sgRNA复合体 获得。野生型等位基因的靶序列表示在框内。
[0051 ]图8显示在Foxnl突变建立者#12中发现的突变等位基因的种系传播。（a)fPCR分 析。（b) PCR基因分型野生型FVB/NTac、建立者小鼠和他们的F1后代。
[0052] 图9显示通过杂交Prkdc突变建立者小鼠产生的胚胎的基因型。Prkdc突变建立者 小鼠必5和罕15杂交并分离E13.5胚胎。（a)fPCR分析野生型，建立者小鼠必5，建立者小鼠早 15。需要注意的是，由于fPCR分析的技术局限性，这些结果显示出与突变等位基因的精确序 列有微小差别；例如，从序列分析，在建立者小鼠必5和罕15中分别鉴定了 Δ 269/ Δ 61/WT和 Δ 5+1/+7/+12/^1(13)产生的胚胎的基因型。
[0053] 图10显示Cas9蛋白质/sgRNA复合体诱导的靶向突变。
[0054] 图11表示重组Cas9蛋白质在拟南芥原生质体中诱导的突变。
[0055]图12表示重组Cas9蛋白质在拟南芥BRI1基因中诱导的突变序列。
[0056] 图13显示T7E1测定，其表明在293细胞中通过Cas9-mal-9R4L和sgRNA/C9R4LC复合 体处理破坏内源性CCR5基因。
[0057]图14 (a，b)显示Fu等（2013)报道的RGEN在标靶位点和脱靶位点上的突变频率。 T7E1测定分析了来自K562细胞的基因组DNA，所述K562细胞顺序转染了20yg Cas9编码质粒 和分别为60yg和120yg的体外转录的GX19crRNA和tracrRNA(l X 106个细胞）（R)，或共转染 了lyg Cas9编码质粒和lyg GX19sgRNA表达质粒(2X105个细胞）（D)。
[0058]图15(a，b)显示向导RNA结构的比较。使用T7E1测定法，测量了标靶和脱靶位点上 的Fu等（2013)报道的RGEN的突变频率。K562细胞共转染了 Cas9编码质粒和编码GX19sgRNA 或GGX20sgRNA的质粒。脱靶位点(0T1 -3等)如Fu等(2013)中标记。
[0059] 图16显示Cas9切口酶在体外DNA切割。（a)Cas9核酸酶和配对的Cas9切口酶的示意 图概略。PAM序列和切割位点显示在框中。（b)人类AAVS1基因座中的靶位点。每个靶位点的 位置以三角形表示。（c)DNA切割反应的示意图概略。FAM染料(示于框内）连接至DNA底物的 两个5'末端。（d)使用荧光毛细管电泳分析DSB和SSB。荧光标记的DNA底物在电泳前与Cas9 核酸酶或切口酶孵育。
[0060] 图17显示Cas9核酸酶和切口酶的行为比较。（a)与Cas9核酸酶（WT)、切口酶 (D10A)、和配对切口酶相关的标靶突变频率。显示产生5'突出端或3'突出端的配对切口酶。 (b)Cas9核酸酶和配对切口酶的脱靶效应分析。分析了三个sgRNA的总共7个潜在的脱靶位 点。
[0061] 图18显示在其他内源性人基因座测试的配对Cas9切口酶。（a，c)在人CCR5和BRCA2 基因座上的sgRNA靶位点。PAM序列显示为红色。（b，d)通过T7E1测定法检测每个靶位点上的 基因组编辑活性。产生5'突出端的两个缺口的修复比产生3'突出端的两个缺口的修复导致 了频繁得多的indel形成。
[0062] 图