一种受体阻滞药的个体化用药检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，涉及一种受体阻滞药的个体化用药检测试剂盒， 具体涉及一种ADRB1基因多态性的检测试剂盒及其构成的反应体系。
【背景技术】
[0002] β肾上腺素受体(β-adrenergic receptor)为肾上腺素受体的一个亚家族，属于G 蛋白偶联受体超家族，包含m、β2和β3三种不同亚型。该类受体通过与Gs蛋白偶联调节细胞 内cAMP和L型Ca2 +通道的开放频率，是β受体激动剂和β受体阻滞剂的作用靶点。 ADRBlGly389Arg(rsl801253)多态性位点的出现，会导致Arg389和Gly389两种类型受体的 产生，而研究者们已经证实Arg389型受体与G蛋白偶联效率要明显高于Gly389型受体，所以 如果高血压患者携带Arg389纯合子基因，则会对降血压药物美托洛尔获得比Gly389型受体 型患者更为明显的疗效，因此CFDA在2015年公布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测 技术指南(试行）》中指出："Arg389纯合子基因型心衰患者应用卡维地洛和美托洛尔治疗后 左室射血分数改善情况更佳。建议临床医师在应用β?受体阻滞药前进行ADRB1多态性检测， 并根据其基因型调整用药剂量，以提高疗效，减少不良反应的发生。"
[0003] 目前ADRB1基因多态性的检测产品主要应用传统固相芯片，液相芯片以及荧光定 量PCR等，这些技术手段均不同程度存在成本高，周期长以及假阳性率高等缺陷。因此，建立 一种检测通量高，操作简便且价格低廉的ADRB1基因多态性检测试剂盒就变得十分重要。环 介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点 是针对革巴基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的 作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生109-101()数量级的产物。反应结束后通过肉 眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无需开管，因此大大简化了操作步 骤，同时又可以有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水浴锅即可开展检测，又节约了大 量的检测成本。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种受体阻滞药的个体化用药检测试剂 盒，具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0005] 为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 第一方面，一种受体阻滞药的个体化用药检测试剂盒，所述试剂盒包括检测引物 组，所述检测引物组如下：
[0007] 正向外侧引物F3:SEQ ID N0:1:GCCAACGTGGTGAAGGC;
[0008] 反向外侧引物B3:SEQ ID N0:2:AGACAGCCCGAGGCG;
[0009] 正向内侧引物FIP:SEQ ID N0:3:TTGGCGTAGCCCAGCCAGACCGCGAGCTGGTGC;
[0010] 反向内侧引物BIPC:SEQ ID N0:4:CGTCTGCTCTGCTGCGCGGGCCGGTCTCCGTGG;
[0011] 反向内侧引物BIPT:SEQ ID N0:5:GGTCTGCTCTGCTGCGCGGGCCGGTCTCCGTGG。
[0012] 优选地，所述SEQ ID NO:卜4所示的序列是用于检测rsl801253位点的C等位基因。 [0013] 优选地，所述SEQIDN0:l-3和SEQIDN0:5所示的序列是用于检测rsl801253位 点的G等位基因。
[0014]本发明中，4条引物的外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物 记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了 Flc和F2，BIP包含了 Blc和B2。本 发明在普通LAMP的基础上，以特异性要求最严格的Flc或Blc的5'端针对rsl801253位点设 计等位基因特异引物，分别检测rsl801253的C等位基因和rsl801253的G等位基因。通过分 别在BIPC和BIPG的5'端第三位引进额外的突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。
[0015]优选地，所述反应体系还包括反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，Bst DNA聚 合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。
[0016]优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0017] 第二方面，本发明提供如第一方面所述的检测试剂盒构建的检测反应体系，所述 反应体系包括第一方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，Bst DNA聚 合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。
[0018] 优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0019] 优选地，所述Tris-HCl 的浓度为 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15禮、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，优选为15-251111，进一步优选为 20mM〇
[0020] 优选地，所述 KC1 的浓度为 10-60mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、15mM、20mM、 25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、46mM、48mM、50mM、51mM、52mM、53mM、55mM、56mM、57mM、58mM、 59mM或60mM，优选为50-55mM，进一步优选为50mM。
[0021 ]优选地，所述（NH4)2S〇4 的浓度为 5-13mM，例如可以是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、 1 OmM、1 ImM、12mM 或 13mM，优选为 8-12mM，进一步优选为 1 OmM。
[0022] 优选地，所述 MgS〇4 的浓度为 2-8mM，例如可以是 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mMS8mM， 优选为2_6mM，进一步优选为4mM。
[0023] 优选地，所述Tween-20的体积分数为0 · 1-1 %，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、 0·4%、0·5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%或1%，优选为0.1%。
[0024] 优选地，所述dNTPs的浓度为 1 -2mM，例如可以是 ImM、1 · ImM、1 · 2mM、1 · 3mM、1 · 4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM 或2mM，优选为 1.2-1.8mM，进一步优选为 1.4mM。
[0025] 优选地，所述羟基萘酚蓝的浓度为108-130μΜ，例如可以是108μΜ、109μΜ、110μΜ、 111卩]?、1124]\1、1154]\1、1164]\1、1184]\1、12(^]\1、1224]\1、1254]\1、1264]\1、1284]\1或13(^]\1，优选为115-123μΜ，进一步优选为120μΜ。
[0026] 优选地，所述甜菜碱的浓度为0-1Μ，例如可以是0Μ、0.2Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、 0 · 8Μ、0 · 9Μ或1Μ，优选为0 · 5-0 · 8Μ，进一步优选为0 · 8Μ。
[0027] 作为优选技术方案，所述反应体系包括反应体系C和反应体系G，其中每个25yL反 应体系含有以下组分：
[0028] 缓冲液：
[0031] 第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：
[0032] 将反应体系C和反应体系G所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反 应后升温进行灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。
[0033] 优选地，所述恒温水浴锅的温度为55-70°C，例如可以是55°C、56°C、57°C、58°C、59 °(3、60°(3、61°(3、62°(3、63°(3、64°(3、65°(3、68°(3或70°(3，优选为58-61°(3，进一步优选为60°(3。
[0034] 优选地，所述反应时间为15_90min，例如可以是15min、16min、18min、20min、 25min、30min、35min、40min、45min、50min、51min、52min、53min、55min、56min、58min、 60min、61min、62min、64min、65min、70min、75min、80min、85mir^90min，tfci￡*55-62min， 进一步优选为60min。
[0035] 优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：
[0036] 反应体系C为天蓝色，反应体系G为紫罗兰，则待测位点基因型为CC;
[0037] 反应体系C为紫罗兰，反应体系G为天蓝色，则待测位点基因型为GG;
[0038] 反应体系C为天蓝色，反应体系G为天蓝色，则待测位点基因型为CG。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0040] (1)本发明试剂盒步骤简单:扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅 中进行反应即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退 火、延伸等变温过程；
[0041] (2)本发明试剂盒高特异性:应用四条引物识别目的片段的六个区域，并且这六个 区域的顺序、长短、退火温度都有相应要求，特异性很高，可以根据是否反应就能判断目标 基因的存在与否，可应用于遗传背景相似的细菌或病毒的分型定性检测；
[0042] (3)本发明试剂盒反应快速、高效:整个反应lh即可完成，且产率高；
[0043] (4)本发明试剂盒鉴定简便:反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结 果的观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上反应是等温进行，不用依赖PCR仪 复杂的循环温度变化来完成，在水浴锅中就能进行，使该检测试剂盒有着更广阔的应用前 景。
【附图说明】
[0044] 图1为本发明试剂盒引物组的示意图；
[0045]图2为本发明试剂盒引物组中的FIP和BIP的示意图；