专利名称：包含IL-15受体α和/或编码IL-15受体α的核酸分子的疫苗和免疫治疗剂,以及其使用方法
技术领域：
本发明涉及改进的疫苗，用于使个体对免疫原预防性和/或治疗性免疫的改进的方法，以及改进的免疫治疗组合物和改进的免疫治疗方法。发明背景
免疫治疗是指调节人的免疫反应来产生需要的治疗效果。免疫治疗剂是指当对个体施用时，充分调节所述个体的免疫系统以最终减少与不希望的免疫反应相关的症状或因増大需要的免疫反应而最终减轻症状的组合物。在一些情况下，免疫治疗是接种方案的一部分，在所述接种方案中，对个体施用的疫苗使所述个体暴露于免疫原，从而在此类情况下，所述个体对所述免疫原产生免疫反应，免疫治疗剂增大了免疫反应和/或选择性地增强了一部分免疫反应(诸如细胞免疫(cellular arm)或体液免疫(humoral arm)),所述免疫反应是治疗或预防特定的病状、感染或疾病所需要的。可通过递送调节人的免疫反应从而诱导改进的免疫反应的药剂来改进疫苗方案。在对个体施用的疫苗使所述个体暴露于免疫原从而所述个体对所述免疫原产生免疫反应的一些接种方案中，所提供的药剂增大免疫反应和/或选择性地增强一部分免疫反应(诸如细胞免疫或体液免疫)，所述免疫反应是治疗或预防特定的病状、感染或疾病所需要的。疫苗可用于使个体对靶抗原(诸如过敏原、病原体抗原或与涉及人类疾病的细胞相关的抗原)免疫。与涉及人类疾病的细胞相关的抗原包括癌症相关的肿瘤抗原和与涉及自身免疫疾病的细胞相关的抗原。在设计此类疫苗吋，已认识到，在接种个体的细胞中产生靶抗原的疫苗可有效诱导免疫系统的细胞免疫。具体来讲，活减毒疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗各自在接种个体的细胞中引起抗原的产生，从而产生免疫系统的细胞免疫的诱导。另ー方面，虽然死疫苗或灭活疫苗和仅包含蛋白质的亚单位疫苗会诱导有效的体液反应，但是它们并不诱导良好的细胞免疫反应。为了提供保护避免病原体感染以及提供用于治疗病原体感染、癌症或自身免疫疾病的有效的免疫介导治疗，细胞免疫反应往往是必要的。因此，往往优选在接种个体的细胞中产生靶抗原的疫苗，诸如活减毒疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗。通过DNA疫苗技术来产生有效的⑶8+T细胞反应是DNA疫苗开发者追求的目标。据报道，在HIV模型以及其它病毒感染中，⑶8+T细胞有助于控制人(Koup等，1994 ；Cao等，1995 ；Musey 等，1997 ；0gg 等，1998 ；Betts 等，1999)和非人灵长类动物模型(Jin 等，1999 ；Schmitz 等，1999 ；Barouch 等，2000 ；Amara 等，2001 ；Shiver 等，2002)的病毒复制。已将许多不同的策略与DNA疫苗技术一起使用，这些策略包括改进的递送技术、增强的构建体设计、异源预激-加强策略(heterologous prime-boost strategies)和使用分子佐剂。包括趋化因子和细胞因子的分子佐剂可以合并到疫苗策略中从而使免疫反应偏向细胞免疫或体液免疫。诸如IL-12和IL-15的细胞因子可有效增强鼠科和非人灵长类动物模型中的免疫反应(Morrow和Weiner, 2008)。已证实白细胞介素-15 (IL-15)在⑶8+T细胞的产生和維持中发挥作用，因为其由共用的β Y链来传导信号，所述共用的β Y链还由IL-2所利用。已证实IL-15在预激(Priming)自然杀伤细胞和⑶8+T细胞期间经由IL_15Ra反式递呈(trans-presented)在抗原递呈细胞的表面上(Dubois 等，2002 ；Koka 等，2004 ；Lucas 等，2007 ；Sato 等，2007)。近期还证实了 IL-15Rci在IL-15分泌的调控中发挥作用(Duitman等，2008)。据认为，这种细胞表面复合物允许IL-15由促进细胞分裂和这些细胞存活的记忆CD8+T细胞上的β Y 受体来传导信号(Lodolce 等，1998 ;Kennedy 等,2000 ;Lodolce 等,2001 ;Burkett 等，2003 ；Burkett 等，2004 ；Sandau 等，2004 ；Schluns 等，2004a ；Schluns 等，2004b)。与单独的任何ー种分子相比，一起作为复合物的IL-15和IL-15RCI显示增强的稳定性和分泌
(Bergamaschi 等，2008)。就质粒编码的IL-15在接种模型中的使用来说，早前已报道了使用其作为HIV-I疫苗佐剂来增强小鼠的溶胞和记忆CD8+T细胞反应(Oh等，2003 ；Kutzler等，2005 ；Zhang等，2006 ；Calarota等，2008 ；Li等，2008)。对恒河猴的研究也证实IL-15增强CD4+T细胞的效应子功能的能力(Picker等，2006)以及救援效应子⑶4+和⑶8+T细胞两者的双重IFN- Y /TNF反应的能力(Halwani等，2008)。重要地是，对恒河猴加用具有SIV/HIV抗原的pIL-15在SHIV89. 6p攻毒之后产生增强的保护(Boyer等，2007)。虽然此类疫苗常常有效地使个体对病原体感染或人类疾病预防性或治疗性免疫，但是仍需要改进的疫苗。需要产生增强的免疫反应的组合物和方法。仍需要改进的策略来使有效的DNA疫苗成为可能，包括增强对DNA疫苗的免疫反应的新佐剂。同样，虽然ー些免疫治疗剂可用于调节患者的免疫反应，但是仍需要改进的免疫治疗组合物和方法。发明概述本发明涉及核酸分子，其包含编码具有IL-15Ra免疫调节功能和/或IL-15结合功能和/或与IL-15受体复合物的其它亚单位结合的功能的蛋白质的SEQ ID NO :1或其片段。本发明涉及一种组合物，其包含编码免疫原的分离的核酸分子连同编码IL-15Ra或其功能片段的分离的核酸分子。本发明进一步涉及一种组合物，其包含编码免疫原和IL-15RCI或其功能片段的分尚的核酸分子。本发明涉及可注射的药物组合物，其包含编码免疫原的分离的核酸分子连同编码IL-15Rα或其功能片段的分尚的核酸分子。本发明涉及可注射的药物组合物，其包含编码免疫原和IL-Ra或其功能片段的分尚的核酸分子。在本发明的ー些方面中，所述免疫原是病原体抗原、癌症相关的抗原或来自与自身免疫疾病相关的细胞的抗原。在ー些方面中，所述病原体是引起慢性感染的病原体。
本发明进ー步涉及诱导个体对免疫原的免疫反应的方法，所述方法包括对所述个体施用组合物，所述组合物包含编码免疫原的分离的核酸分子连同编码IL-15RCI或其功能片段的分离的核酸分子。本发明进ー步涉及诱导个体对免疫原的免疫反应的方法，所述方法包括对所述个体施用编码免疫原和IL-15Ra或其功能片段的核酸分子。本发明进一步涉及重组疫苗，其包含编码可操作地连接于调控元件的免疫原的核苷酸序列，编码IL-15RCI或其功能片段的核苷酸序列；并且，涉及诱导个体对免疫原的免疫反应的方法，所述方法包括对个体施用此重组疫苗。本发明进一步涉及一种活减毒病原体，其包含编码IL-15RCI或其功能片段的核苷酸序列；并且，涉及诱导个体对病原体的免疫反应的方法，所 述 方法包括对个体施用所述活减毒病原体。附图简述
图1A-1E展示与IL-15Ra单克隆抗体的产生相关的结果和信息。图IA展示重组人IL-15Ra蛋白在12. O至.16 μ g蛋白质的2倍稀释液中的考马斯染色。图IB展示商业化抗人IL-15Ra抗体可在直接的ELISA中检测重组IL-15Rα蛋白。图IC展示用于BALB/c小鼠中的抗人IL-15Ra单克隆抗体产生的免疫程序。图ID通过ELISA展示来自克隆KKl. 23的杂交瘤上清液具有对重组IL-15Rα蛋白的高抗体效价。图IE展示纯化的单克隆抗体KKl. 23在ELISA中结合重组IL_15Ra并且通过蛋白质印迹分析具体地展示。图2A-2G涉及IL-15R a DNA质粒的构建和表达。图2A描绘如何将人IL_15Ra CDNA插入pVAXl表达载体中。图2B和2C展示质粒IL-15Ra表达了适当大小的蛋白质(约30kDa)，分别由用R&D和KKl. 23单克隆抗人IL-15R α抗体进行的放射性活体外翻译来检测。图2D展示单克隆KKl. 23抗体(IgGl同种型)不结合非转染的HeLa细胞(20χ)。图2Ε展示由小鼠IgGl同种型对照染色的pTRACER-IL-15Ra转染细胞(绿色)(20x)。图2F和2G分别以20x和60x展示KKl. 23抗人IL-15R α抗体(红色)结合pIL_15R a -pTRACER转染的细胞。图3A-3C展示与单独递送的任何一种质粒相比，pIL-15和pIL_15Ra的组合增强免疫反应。图3A展示用含有载体、抗原质粒(HIV-Igag和pol)、pIL_15和/或pIL_15R α的组合的DNA制剂注射的BALB/c小鼠组的免疫程序。pIL-15/pIL_15Rα的组合是在同一只腿上给予或在两只不同的腿上分开给予(一只腿上给予PIL-15，另ー只腿上给予pIL-15Ra)0使用电穿孔3次进行肌内免疫，并在最后的加强之后一周将小鼠处死。图3B和3C展示细胞反应。在IFN-Y ELISpot试验中使用来自免疫小鼠的脾细胞。用培养基(阴性对照)、伴刀豆球蛋白A(阳性对照)或抗原肽(HIV-Igag和pol池)将脾细胞刺激过夜并将IFN-Y斑点形成单元计数。图4A和4B展示在无pIL-15情况下，IL_15Ra DNA质粒的免疫原性是剂量依赖方式的。如图3A所示，将BALB/c小鼠用含有载体、5 μ g抗原质粒(HIV-Igag和pol)和渐增剂量的IL-15Ra (7. 5、10或15μ g)的组合的DNA制剂来免疫。在用RlO (阴性对照)、ConA (阳性对照)和HIV-Igag肽池或HIV-Ipol肽池刺激的脾细胞上进行IFN- y ELIspot0图4A中展示使用HIV-Igag肽池的实验数据。图4B中展示使用HIV-Ipol肽池的实验数据。
图5A和5B展示pIL_15R α主要通过CD8+T细胞增强IFN- Y分泌。由CD8+T细胞贡献的IFN- Y分泌是通过使用Miltenyi珠使来自免疫小鼠脾细胞的CD8+T细胞的体外去除来測量。图5Α展示全脾细胞(黒色条形图)和CD8去除的脾细胞(灰色条形图)的总抗原反应，并且所述总抗原反应是通过IFN-YELISpot来测量。在图5Β中，对HIV-Igag ρ24抗原蛋白质的抗体效价是从用如物料和方法中所述的相同构建体和时间安排免疫的BALB/c小鼠的血清样品測定。将在处死时获取的血清的稀释液在接种ρ24的ELISA板上操作并且用抗小鼠IgG-HRP抗体检测以測定抗原特异性IgG的水平。在绘图之前，将仅有稀释剂的孔中的背景反应从样品OD值中减去。图6Α至6C展示pIL-15和pIL_15Ra的组合没有增强记忆反应。将小鼠免疫三次并在处死之前静养30周。图6A展示IFN- Y分泌是通过IFN- y ELISpot从免疫小鼠的脾细胞中测量。图6B展示用于从免疫小鼠测定记忆反应的细胞内细胞因子染色。将来自免疫小鼠的脾细胞在布雷菲尔德菌素A存在下用培养基、PMA/离子霉素或优势和亚优势HIV-Igag和pol抗原肽刺激5小吋。在图6C中，从免疫小鼠获取血清并在HIV-IgagP24ELISA上操作。分析血清稀释液的抗原特异性IgG。在绘图之前，将仅有稀释剂的孔中的背景反应仅从样品OD值中减去。 图7A至7C展示在没有内源性IL-15的情况下pIL_15Ra可以作为佐剂。为了探究IL-15Ra作为佐剂的机理，我们考察了人IL-15Ra结合鼠IL-15的能力。图7A展示放射性标记的人IL-15Ra结合小鼠IL-15并且与抗小鼠IL-15抗体一起共同免疫沉淀。根据在图3A中的程序，在对照C57BL/6(在图7B中展示)和IL-15敲除的小鼠(在图7C中展示)中也重复了免疫，并且对脾细胞进行IFN-YELISpots。优选实施方案的详细描述如本文所用的术语“IL_15Ra”是指白细胞介素15受体α蛋白。如本文所用的“功能片段”意指IL_15Ra的片段，当与免疫原一起递送时，与在没有所述片段的情况下递送免疫原时诱导的免疫相比，所述片段提供増大的免疫反应。片段长度通常是10个或10个以上氨基酸。如本文所用的术语“靶蛋白”意指由本发明的基因构建体编码的肽和蛋白质，其充当免疫反应的靶蛋白。术语“靶蛋白”和“免疫原”可互換使用，并且是指可引出免疫反应的蛋白质。靶蛋白是免疫原性的蛋白质，其与来自病原体或不希望的细胞类型(诸如癌细胞或需要免疫反应的涉及自身免疫疾病的细胞)的蛋白质共用至少ー个表位。针对靶蛋白的免疫反应将保护个体免受与所述靶蛋白相关的特定感染或疾病，和/或治疗个体的与所述靶蛋白相关的特定感染或疾病。如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括可操作地连接于调控元件的起始和终止信号，所述起始和終止信号包括能够在施用所述核酸分子的个体的细胞中引导表达的启动子和多腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达形式”是指基因构建体，其含有可操作地连接于编码靶蛋白或免疫调节蛋白的编码序列的必要调控元件，以在存在于所述个体的细胞中时，使得所述编码序列可得以表达。如本文所用的术语“共用ー个表位”是指包含至少ー个与另ー种蛋白质的表位相同或大体上类似的表位的蛋白质。
如本文所用的术语“大体上类似的表位”意指具有与蛋白质的表位不相同的结构，但仍然引起与所述蛋白质交叉反应的细胞或体液免疫反应的表位。如本文所用的术语“细胞内病原体”意指病毒或病原生生物体，它们的繁殖或生命周期的至少部分是处于宿主细胞内，并且在宿主细胞中产生病原体蛋白质或引起病原体蛋白质的产生。如本文所用的术语“过度増殖性疾病”意指特征为细胞过度増殖的疾病和病症。如本文所用的术语“过度増殖性相关的蛋白质”意指与过度増殖性疾病相关的蛋白质。本发明源自以下发现当作为疫苗的部分来递送时，编码IL_15Ra和其功能片段的核酸分子和其组合调节免疫反应。因此，编码IL-15Ra和其功能片段的核酸分子和其组合可作为免疫治疗剂与疫苗组合来递送或作为疫苗的组分来递送。此外，本发明源自以下发现当作为疫苗的部分来递送时，编码IL_15Ra或其功能片段的核酸分子连同IL-15或其功能片段的核酸分子调节免疫反应。因此，编码IL-15Ra或其功能片段的核酸分子连同IL-15或功能片段的核酸分子可作为免疫治疗剂与疫苗组合来递送或作为疫苗的和其组合来递送。本发明的ー些方面提供IL_15Ra蛋白质的核酸编码序列在治疗疫苗中的用途，特别是在不需要CD8+记忆T细胞反应的此类情况下在治疗疫苗中的用途。此类治疗疫苗包括其中的抗原标靶是在正常以及疾病相关的细胞中表达的抗原的疫苗，借此，带有抗原的细胞的短期消除具有治疗效果，而没有针对表达所述抗原的正常细胞的长期免疫反应。因此，本发明的这方面特别可用于针对癌细胞上的抗原(也存在于正常细胞上的抗原)的治疗疫苗、针对由与自身免疫疾病相关的细胞表达的抗原(也存在于正常细胞上的抗原)的治疗疫苗，以及针对涉及不希望有持久免疫反应的慢性感染的病原体抗原的治疗疫苗。慢性感染是指病原体未被清除的病原体感染。实例包括但不限于HCV、HSV、CMV、水痘、HIV等，相对来说，急性感染诸如脊髓灰质炎、天花、腮腺炎等。本发明ー些方面提供编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列连同编码IL-15的核酸编码序列在治疗疫苗中的用途，特别是在不需要增强的爆发免疫反应(burst immuneresponse)的此类情况下在治疗疫苗中的用途。在免疫反应的初始诱导后，IL_15Ra蛋白的核酸编码序列和编码IL-15的核酸编码序列的组合提供累加的佐剂效应。可以对与编码IL-15的核酸编码序列或编码IL-15Ra蛋白的核酸编码序列相同的位点施用编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列，并且所述核酸编码序列可以递送到不同位点以便实现累加的免疫反应。人IL_15Ra的核苷酸序列公开为基因库登录号NM172200和NM002189，将其各自以引用方式并入本文。人IL-15Ra的蛋白质序列公开为基因库登录号Q13261、NP002180和NP751950，将其各自以引用方式并入本文。在本发明的一些实施方案中，将编码IL-15Ra蛋白的核酸编码序列进行优化以达到高水平的表达。在本发明的一些实施方案中，将编码IL-15Ra蛋白的核酸编码序列进行优化，诸如SEQ ID NO :1的核酸编码序列。在本发明的一些实施方案中，编码IL-15Ra蛋白的核酸编码序列是未优化的，诸如SEQ ID NO :2的核酸编码序列。人IL-15的核苷酸序列公开为基因库登录号匪172174和NM000585，将其各自以引用方式并入本文。人IL-15的蛋白质序列公开为基因库登录号CAA86100、CAA62616、AAI00964、CAA72044、AAH18149和AAU21241，将其各自以引用方式并入本文。在本发明的一些实施方案中，将编码IL-15蛋白的核酸编码序列进行优化以达到高水平的表达。在一些实施方案中，使用诸如在美国专利第10/560,650号(US 20070041941)中描述的改进的IL-15构建体，将所述美国专利以引用方式并入本文。在一些实施方案中，使用诸如在美国专利第12/160，766号中描述的改进的IL-15构建体，将所述美国专利以引用方式并入本文。在本发明的一些实施方案中，编码IL-15蛋白的核酸编码序列是SEQ ID NO :3。在本发明的一些实施方案中，编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列和编码靶抗原的核酸编码序列各自在相同质粒上。在本发明的一些实施方案中，提供一种组合物，其包含两个质粒第一质粒包含编码IL-15Ra蛋白的核酸编码序列；第二质粒包含编码靶抗原的核酸编码序列，所述核酸编码序列各自在相同质粒上。在本发明的一些实施方案中，提供两种组合物。第一种组合物包含ー个质粒，其包 含编码IL-15Ra蛋白的核酸编码序列，并且第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码靶抗原的核酸编码序列，所述核酸编码序列各自在相同质粒上。两种组合物可提供在独立的容器中并且包装成试剂盒。在本发明的一些实施方案中，编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列、编码IL-15的核酸编码序列和编码靶抗原的核酸编码序列各自在相同质粒上。在本发明的一些实施方案中，本发明提供包含两个质粒的组合物。编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列和编码IL-15的核酸编码序列在一个质粒上并且编码靶抗原的核酸编码序列在第二质粒上。在本发明的一些实施方案中，本发明提供包含三个质粒的组合物。编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列在第一质粒上，编码IL-15的核酸编码序列在第二质粒上并且编码靶抗原的核酸编码序列在第三质粒上。在本发明的一些实施方案中，本发明提供两种组合物，第一种组合物包含ー个质粒并且第二种组合物包含ー个质粒。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列和编码靶抗原的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL-15的核酸编码序列。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL-15蛋白的核酸编码序列和编码靶抗原的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL-15Ra的核酸编码序列。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL-15蛋白的核酸编码序列和编码IL-15Ra的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码靶抗原的核酸编码序列。所述多种组合物可提供在被包装形成试剂盒的独立容器中。在本发明的一些实施方案中，本发明提供两种组合物，第一种组合物包含两个质粒并且第二种组合物包含ー个质粒。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含第一质粒，其包含编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列；和第二质粒，其包含编码靶抗原的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL-15的核酸编码序列。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含第一质粒，其包含编码IL-15蛋白的核酸编码序列；和第二质粒，其包含编码靶抗原的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL_15Ra的核酸编码序列。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含第一质粒，其包含编码IL-15蛋白的核酸编码序列；和第二质粒，其包含编码IL_15Ra的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码靶抗原的核酸编码序列。所述多种组合物可提供在被包装形成试剂盒的独立容器中。在本发明的一些实施方案中，本发明提供三种组合物，第一种组合物包含ー个质粒，第二种组合物包含ー个质粒并且第三种组合物包含ー个质粒。在一些此类实施方案中，第一种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL_15Ra蛋白的核酸编码序列。第二种组合物包含ー个质粒，其包含编码靶抗原的核酸编码序列。第三种组合物包含ー个质粒，其包含编码IL-15的核酸编码序列。所述多种组合物可提供在被包装形成试剂盒的独立容器中。编码免疫调节蛋白的分离的cDNA可用作构建可产生所述免疫调节蛋白的构建体的起始物质。可使用标准技术和易获得的起始物质制备编码免疫调节蛋白的核酸分子。可使用许多众所周知技术的任何技术来递送核酸分子，这些技术包括DNA注射(也称为DNA接种)、重组载体，诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关的病毒和重组牛痘病毒。 DNA疫苗描述于美国专利第5，593，972、第5，739，118号、第5，817，637号、第5，830，876 号、第 5，962，428 号、第 5，981，505 号、第 5，580，859 号、第 5，703，055 号、第5，676，594号以及这些专利中引用的优先权申请中，将各专利以引用方式并入本文。除了在那些申请中描述的递送方案外，递送DNA的替代方法描述于美国专利第4，945，050号和第5，036，006号中，将这两个申请以引用方式并入本文。施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和ロ部以及局部、透皮、通过吸入或栓剂施用或对粘膜组织施用，诸如通过对阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织灌洗施用。优选的施用途径包括粘膜组织、肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建体可借助包括但不限于传统注射器、无针注射装置或“微弹轰击基因枪Uiiicroprojectile bombardment gene gunsノ，，的万法来施用。另ー种施用途径涉及使用电穿孔来递送遗传构建体，如在美国专利第5，273，525号、第 5，439，440 号、第 5，702，359 号、第 5，810，762 号、第 5，993，434 号、第 6，014，584 号、第 6, 055, 453 号、第 6, 068, 650 号、第 6, 110, 161 号、第 6, 120, 493 号、第 6, 135, 990 号、第 6，181，964 号、第 6，216，034 号、第 6，233，482 号、第 6，241，701 号、第 6，347，247 号、第 6, 418, 341 号、第 6, 451, 002 号、第 6, 516, 223 号、第 6, 567, 694 号、第 6, 569, 149 号、第 6，610，044 号、第 6，654，636 号、第 6，678，556 号、第 6，697，669 号、第 6，763，264 号、第6，778，853号、第6，865，416号、第6，939，862号和第6，958，060号中所述，所述美国专利在此以引用方式并入本文。当被细胞吸收时，遗传构建体可作为发挥作用的染色体外分子保留在细胞中。可以ー个质粒或多个质粒的形式将DNA引入细胞内，所述DNA在所述细胞中短暂存在(transient basis)。或者,可对所述细胞施用RNA。本发明也涵盖提供作为线性微型染色体的遗传构建体，其包括着丝点、端粒和复制起点。基因构建体可构成对受试者施用的减毒活微生物或重组微生物载体中的遗传物质的部分。基因构建体可以是重组病毒疫苗的基因组的部分，其中所述遗传物质保留在染色体外。遗传构建体包括核酸分子的基因表达所必需的调控元件。所述元件包括启动子、起始密码子、終止密码子和多腺苷酸化信号。此外，编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达常常需要增强子。这些元件必需可操作地连接于编码所需蛋白质的序列，而且所述调控元件必需在其所施用的个体中是可操作的。通常认为起始密码子和終止密码子是编码所需蛋白质的核苷酸序列的部分。然而，这些元件必需在施用基因构建体的个体中是功能性的。起始密码子和終止密码子必须与编码序列一起在框架中。使用的启动子和多腺苷酸化信号必须在所述个体细胞内是功能性的。用于实践本发明，尤其用于产生人用遗传疫苗的启动子的实例包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(MV)(诸如BIV长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)、ALV、巨细胞病毒(CMV)(诸如CMV早期瞬时启动子)、Epstein Barr病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及来自人类基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和人金属硫蛋白。 用于实践本发明，尤其用于产生人用遗传疫苗的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多腺苷酸化信号、牛生长激素多腺苷酸化(bgh-PolyA)信号和LTR多腺苷酸化信号。具体来讲，使用在pCEP4质粒(Invitrogen, San Diego Calif.)中的SV40多腺苷酸化信号，称为SV40多腺苷酸化信号。除了 DNA表达所需的调控元件外，在DNA分子中也可以包括其它元件。此类其它的元件包括增强子。增强子可选自包括但不限于以下的组人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸，以及病毒增强子，诸如来自CMV、RSV和EBV的病毒增强子。为了使构建体保持在染色体外并且在细胞中产生所述构建体的多个拷贝，可提供具有哺乳动物复制起点的遗传构建体。来自Invitrogen (San Diego, Calif.)的质粒pVAX
I、pCEP4和pREP4都含有Epstein Barr病毒复制起点和产生高拷贝游离型复制而无整合作用的核抗原EBNA-I编码区域。在与免疫应用相关的ー些优选实施方案中，递送的核酸分子包括编码靶蛋白、免疫调节蛋白和，此外，进ー步增强对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白质的基因的核苷酸序列。此类基因的实例是编码其它细胞因子和淋巴因子的基因，所述因子诸如α-干扰素、Y-干扰素、血小板衍生生长因子O3DGF)、TNF、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-U IL-2、11_4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15，包括具有缺失的信号序列并且任选包括来自IgE的信号肽的IL-15。在所述方法中使用的组合物可进ー步包含ー种或多种以下蛋白和/或编码此类蛋白的核酸分子，如以引用方式并入本文的美国专利第10/139，423号(对应于美国公布第20030176378号)中所述主要组织相容性复合体抗原，包括主要组织相容性复合体I类抗原或主要组织相容性复合体II类抗原；死亡结构域受体，包括但不限于Apo-1、Fas、TNFR-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6 ;死亡信号，即与死亡结构域受体相互作用的蛋白质，包括但不限于FADD、FAP-1、TRADD, RIP、FLICE和RAIDD ;或包括结合死亡结构域受体并引发细胞凋亡的配体的死亡信号，包括但不限于FAS-L和TNF ;以及，与死亡结构域受体相互作用的介体，包括但不限于FADD>MORTI和MyD88 ;包括杀死细胞的蛋白质的毒素,诸如但不限于昆虫毒和蛇毒、细菌内毒素(诸如绿脓杆菌(Psuedomoneus)内毒素)、双链核糖体灭活蛋白质(诸如蓖麻毒素，包括单链毒素和白树毒素)。在所述方法中使用的组合物可进ー步包含ー种或多种以下蛋白和/或编码此类蛋白的核酸分子，如以引用方式并入本文的美国专利第10/560,650号(对应于美国公布第20070041941号)中所述IL_15，其包括包含连接于IL-15蛋白序列的非IL-15信号肽的融合蛋白(诸如包含连接于IL-15蛋白序列的IgE信号肽的融合蛋白)，⑶40L、TRAIL ；TRAILrecDRC5、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40 LIGAND、NKG2D、F461811 或 MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、CD30、CD153 (CD30L)、Fos、c-jun、Sp-l、Apl、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、NIK、SAPK、SAPl、JNK2、JNK1B2、JNKlBU JNK2B2、JNK2B1、JNK1A2、JNK2A1、JNK3A1、JNK3A2、NF-κ -B2、p49 剪接形式、NF- κ -B2、plOO 剪接形式、NF- κ -Β2、ρ105 剪接形式、NF- κ -Β50Κ 链前体、NFkBp50,人 IL-I α、人 IL-2、人 IL-4、鼠 IL-4、人 IL-5、人 IL-10、人 IL-15、人 IL-18、人 TNF- α、人 TNF-β、人白细胞介素 12、MadCAM-U NGF IL-7、VEGF、TNF-R、Fas、CD40L、IL-4, CSF、G-CSF, GM-CSF、M-CSF, LFA-3、I CAM-3, I CAM-2, ICAM-U PECAM、P150. 95、Mac-1, LFA-UCD34、RANTES, IL-8、MIP-I a、E-选择体、CD2、MCP-I、L-选择体、P-选择体、FLT、Apo-I、Fas、TNFR-I、p55、WSL-U DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF、DR4 (TRAIL)、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、ICE、VLA-1 和 CD86 (B7. 2)。在所述方法中使用的组合物可进ー步包含ー种或多种以下蛋白和/或编码此类 蛋白的核酸分子，如以引用方式并入本文的美国专利第10/560，653号(对应于美国公布第 20070104686 号)中所述Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、灭活的 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl 和 TAP2。如果出于任何原因需要消除接受遗传构建体的细胞，那么可加入担当细胞破坏标靶的另一元件。在所述遗传构建体中可包括可表达形式的疱疹胸腺嘧啶激酶(tk)基因。可对个体施用药物更昔洛,(gangcyclovir),而此药物将会引起任何产生tk的细胞的选择性杀死，从而提供用于具有所述遗传构建体的细胞的选择性破坏的方法。为了最大化蛋白质产生，可选择良好适合于施用所述构建体的细胞中的基因表达的调控序列。此外，可选择在细胞中最有效转录的密码子。本领域普通技术人员可以制造在细胞中有功能性的DNA构建体。在一些实施方案中，可以提供基因构建体以便产生本文所描述的连接于IgE信号肽的免疫调节蛋白的编码序列。本发明的ー种方法包括以下步骤通过肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部施用核酸分子或通过灌洗选自由吸入、阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组成的组的粘膜组织施用核酸分子。在一些实施方案中，将核酸分子与多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗促进剂一起递送给细胞。多核苷酸功能增强剂描述于美国专利第5，593，972号和第5，962，428号中，这两个专利各自以引用方式并入本文。遗传疫苗促进剂描述于美国专利第5，739，118号中，将其以引用方式并入本文。与核酸分子联合施用的辅剂可以作为与核酸分子的混合物施用，或在施用核酸分子的同时、之前或之后独立地施用。此外，可具有起转染剂和/或复制剂和/或炎性剂功能并且可以与多核苷酸功能增强剂共同施用的其它药剂包括生长因子、细胞因子和淋巴因子，诸如α-干扰素、Y-干扰素、GM-CSF、血小板衍生生长因子(TOGF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂(诸如免疫刺激性复合物(ISCOMS))、LPS类似物(包括单磷酰脂A(WL))、胞壁酰肽、醌类似物和泡囊(诸如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可以与遗传构建体一起施用。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可用作多核苷酸功能增强剂。在一些实施方案中，为了增强递送/摄取，将核酸分子与聚(丙交酷-共聚-こ交酷)(PLG)联合提供。根据本发明的药物组合物包含约I纳克至约2000微克的DNA。在ー些优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约O. I至约500微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约I至约350微克的DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克的DNA。在ー些优选实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克的DNA。根据本发明的药物组合物是根据所用的施用模式来配制。在药物组合物是可注射
的药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原和无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂加入制剂中。根据本发明的实施方案，提供了诱导对免疫原的免疫反应的方法，该方法包括对个体递送免疫原和IL-15RCI或其功能片段的组合。所述疫苗可以是活减毒疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。本发明可用于引出对靶蛋白，即对特别与病原体、过敏原或个体自身的“异常”细胞相关的蛋白质的增强的免疫反应。本发明可用于使个体对致病因子和病原生生物体免疫，以使对病原体蛋白质的免疫反应提供对所述病原体的保护性免疫。本发明可用于通过引出对特别与所述过度増殖性细胞相关的靶蛋白的免疫反应来对抗过度増殖性疾病和病症，诸如癌症。本发明可用于通过引起对特别与涉及所述自身免疫病状的细胞相关的靶蛋白的免疫反应来抵抗自身免疫疾病和病症。根据本发明的ー些方面，将编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA引入表达它的个体的组织细胞中，从而产生编码的蛋白质。编码所述靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA序列与个体的细胞表达所必需的调控元件连接。用于DNA表达的调控元件包括启动子和多腺苷酸化信号。此外，所述遗传构建体中也可以包括诸如Kozak区域的其它元件。在一些实施方案中，编码靶蛋白的可表达形式的序列和编码两种免疫调节蛋白的可表达形式的序列均出现在递送到个体的同一核酸分子上。在一些实施方案中，编码靶蛋白的可表达形式的序列出现在与编码免疫调节蛋白的可表达形式的序列的不同的核酸分子上。在一些实施方案中，编码靶蛋白的序列的可表达形式和编码ー种或多种免疫调节蛋白质的可表达形式的序列出现在与含有编码免疫调节蛋白的可表达形式的序列的核酸分子不同的核酸分子上。可根据本发明来产生和递送多种不同的核酸分子。核酸分子可以质粒DNA、重组载体的核酸分子或减毒疫苗中提供的遗传物质的部分形式来提供。或者，在一些实施方案中，除了编码它们的核酸分子之外或代替编码它们的核酸分子，靶蛋白和免疫调节蛋白可以蛋白质形式递送。
遗传构建体可包含编码可操作地连接于基因表达所需的调控元件的靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列。根据本发明，提供基因构建体组合物，其包括ー个包含编码靶蛋白的可表达形式的核苷酸序列的构建体和ー个包含编码免疫调节蛋白的可表达形式的核苷酸序列的构建体。将包括所述基因构建体组合的DNA或RNA分子递送到活细胞中引起DNA或RNA的表达以及靶蛋白和ー种或多种免疫调节蛋白的产生。产生了对靶蛋白的增强免疫反应。本发明可用于使个体对诸如病毒、原核生物和病原真核生物体(诸如单细胞病原生物体和多细胞寄生虫)的病原体免疫。本发明特别可用于使个体对感染细胞并且不被囊封的病原体免疫，所述病原体诸如病毒和原核生物，诸如淋病病毒、李斯特菌和志贺菌。此夕卜，本发明也可用于使个体对原生动物病原体免疫，所述原生动物病原体包括在生命周期中它们是细胞内病原体的阶段。表I提供ー些病毒科和属的列表，可根据本发明产生用于所述病毒科和属的疫苗。包含编码包含至少ー个与病原体抗原(诸如列于表中的抗原)上呈现的表位相同或大体上类似的表位的肽的DNA序列的DNA构建体可用于疫苗。此外，本发明也可用于使个体对其它病原体免疫，所述其它病原体包括原核和真核原生动物病原体 以及诸如列于表2中的多细胞寄生虫。本领域技术人员可容易地鉴别和区分引起慢性感染的病原体与感染后被清除的病原体(即急性传染)。表表I-病毒微小核糖核酸病毒科属鼻病毒(医学)引起-50%普通感冒病例。肠病毒(医学)包括脊髄灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和人肠道病毒，诸如甲肝病毒。ロ疮病毒(兽医学)它们是ロ蹄疫病毒。靶抗原VP1、VP2、VP3、VP4、VPG杯状病毒科属诺瓦克群病毒(医学)它们是流行性胃肠炎的重要致病病因。披膜病毒科属α病毒(医学和兽医学)实例包括辛德毕斯病毒、罗斯河病毒和委内瑞拉东方&西方马脑炎病毒。呼肠孤病毒(医学)风疫病毒。黄病毒科实例包括(医学)登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和虱传脑炎病毒。西尼罗河病毒(基因库NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、Μ12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518 和 AF202541)代表性靶抗原E NS5 C
丙肝病毒(医学)这些病毒不属于任何科，但又被认为是被膜病毒或黄病毒。大多数类似于被膜病毒科。冠状病毒科(医学和兽医学)传染性支气管炎病毒(家禽)猪可传播性胃肠道病毒(猪)猪凝血性脑脊髄炎病毒(猪)猫传染性腹膜炎病毒(猫)猫肠道冠状病毒(猫)犬冠状病毒(犬) SARS相关的冠状病毒人呼吸道冠状病毒引起约40%的普通感冒病例。EX. 224E、0C43注意-冠状病毒可引起非甲、非こ或非丙型肝炎靶抗原E1-也称为M或基质蛋白E2-也称为S或刺突蛋白E3-也称为BE或血凝素-elterose糖蛋白(不存在于所有冠状病毒中)N_壳包核酸弹状病毒科属水疱病毒、狂犬病病毒(医学和兽医学)狂犬病；靶抗原G蛋白、N蛋白线状病毒科(医学)出血热病毒，诸如马堡病毒和埃博拉病毒副粘病毒科属副粘病毒(医学和兽医学)腮腺炎病毒、新城疫病毒(重要的鸡病原体)麻疹病毒(医学和兽医学)麻疹、犬瘟热肺病毒(医学和兽医学)呼吸道合胞病毒
正粘液病毒科(医学)流感病毒布尼亚病毒科属布尼亚病毒(医学)加利福尼亚脑炎、拉克罗斯脑炎(La Crosse)白蛉热病毒(医学)里夫特山谷热汉坦病韋Puremala是一种hemahagin热病韋内罗毕病毒(兽医学)内罗毕绵羊病还有许多未分类的布尼亚病毒沙粒病毒科(医学)LCM、拉沙热病毒呼肠孤病毒科属呼肠孤病毒ー种可能的人病原体轮状病毒儿童急性胃肠炎环状病毒(医学和兽医学)科罗拉多虱传热、
莱邦博(Lebombo)(人)马脑炎、蓝舌病逆转录病毒科亚科致癌病毒(兽医学)(医学)猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII慢病毒(医学和兽医学)HIV、猫免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒Spumavirinal乳多泡病韋科亚科多瘤病毒(医学)BKU和JCU病毒亚科乳头瘤病毒(医学)与癌症或乳头瘤恶性进展相关的许多病毒类型。 腺病毒(医学)EX AD7、ARD.、0.B.-引起呼吸道疾病-一些腺病毒，诸如275引起肠炎细小病毒科(兽医学)猫细小病毒引起猫肠炎猫瘟病毒犬细小病毒猪细小病毒疱疹病毒科亚科α疱疫病毒属单纯疱疹病毒(医学)HSVI (基因库 X14112、NC001806)、HSVII(NC001798)水痘病毒(医学兽医学)假性狂犬病水痘病毒亚科β疱疹病毒属巨细胞病毒(医学)HCMV鼠巨细胞病毒亚科y疱疹病毒属淋巴隐病毒(医学)EBV-(伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma))痘病毒科亚科带状痘病毒(医学-兽医学)
属天花(天花病毒)牛痘(牛痘病毒)副痘病毒-兽医学禽痘病毒-兽医学山羊痘病毒兔痘病毒
猪痘病毒亚科昆虫痘病毒肝DNA病毒科こ肝病毒未分类的肝炎δ病毒表2细菌病原体病原性革兰阳性球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌和链球菌。病原性革兰阴性球菌包括脑膜炎球菌和淋球菌。病原性革兰阴性肠道杆菌包括肠杆菌；假单胞菌、不动细菌和艾肯菌、类鼻疽；沙门菌；志贺菌；嗜血杆菌；软性下疳；布鲁菌；土拉菌；耶尔森菌(巴斯德菌)；念珠状链杆菌和螺旋菌；单核细胞增生李斯特菌；红斑丹毒丝菌；白喉杆菌、霍乱杆菌、炭疽杆菌；杜诺万菌(性病性肉芽肿)和巴尔通氏体。病原性厌氧菌包括破伤风杆菌；肉毒梭菌；其它梭菌；结核杆菌；麻风杆菌和其它分枝杆菌。病原性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病热带肉芽肿、品他病和地方性梅毒和钩端螺旋体病。由较高级病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病、酵母病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉菌病；孢子丝菌病；巴西芽生菌病、霉样真菌病、球拟酵母菌病、足分枝菌病和染色芽生菌病和皮肤真菌病。立克次体感染包括立克次体感染和立克次体病。支原体和衣原体感染的实例包括支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和产期衣原体感染。病原性真核生物病原性原生动物和蠕虫以及由其引起的感染包括阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形体病；卡氏肺囊虫病；巴贝虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫病和绦虫(cestode/tapeworm)感染。为了产生预防病原体感染的遗传疫苗，在遗传构建体中必须包括编码免疫原性蛋白质(可对所述免疫原性蛋白质产生保护性免疫反应)的遗传物质作为标靶的编码序列。因为DNA和RNA两者都相对较小并且可以相对容易地产生，所以本发明提供允许用多种病原体抗原接种的另外的优点。遗传疫苗中使用的遗传构建体可包括编码许多病原体抗原的遗传物质。例如，在单ー构建体中可以包括若干病毒基因从而提供多个标靶。表I和表2包括一些病原体和生物体的列表,可以制备保护个体免受它们感染的遗传疫苗。在一些优选实施方案中，使个体对病原体免疫的方法针对人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、丙肝病毒(HCV)、西尼罗河病毒(West Nile Virus, WNV)或こ肝病毒(HBV)。本发明的另ー个方面提供一种赋予对过度増殖性疾病中特有的过度増殖性细胞的保护性免疫反应的方法和一种治疗患有过度增殖性疾病的个体的方法。过度增殖性疾病的实例包括所有形式的癌症和银屑病。已发现向个体的细胞中引入包括编码免疫原性的“过度増殖性细胞”相关的蛋白质的核苷酸序列的遗传构建体会引起个体的接种细胞中产生那些蛋白质。为了对过度增殖性疾病免疫，对个体施用包括编码与过度増殖性疾病相关的蛋白质的核苷酸序列的遗传构建体。 为了使过度増殖性相关的蛋白质成为有效的免疫原性标靶，其必须专门在过度增殖性细胞中产生或与正常细胞相比，在过度增殖性细胞中以较高水平产生。靶抗原包括此类蛋白质、其片段和肽；其包含出现在此类蛋白质上的至少ー个表位。在一些情况下，过度増殖性相关的蛋白质是编码蛋白质的基因突变的产物。突变的基因编码的蛋白质与正常蛋白质几乎相同，只是其氨基酸序列稍有不同从而产生正常蛋白质上没有的不同表位。此类革巴蛋白包括由诸如myb、myc、fyn的致癌基因和转位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的蛋白质。除了作为靶抗原的致癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护性疗法的靶蛋白包括由B细胞淋巴瘤产生的抗体可变区和由T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，它们也可用作自身免疫疾病的靶抗原。可以用其它肿瘤相关的蛋白质，诸如在肿瘤细胞中以较高水平出现的蛋白质来作为靶蛋白，包括单克隆抗体17-IA识别的蛋白质和叶酸结合蛋白或PSA。虽然本发明可用于使个体对若干癌症形式中的一种或多种癌症形式免疫，但是本发明特别可用于使易患癌症或已患上癌症并且因此易复发的个体预防性免疫。遗传学和技术以及流行病学的发展使得对个体患上癌症的可能性确定和风险评估成为可能。使用遗传筛选和/或家族健康史，有可能预测特定个体患上若干癌症类型中的任一类型癌症的可能性。类似地，已经患上癌症并且已受治疗去除癌症或处于缓解期的那些个体尤其容易复发和复现癌症。作为治疗疗法的一部分，可以使这些个体对其已被确诊患有的癌症免疫以对抗癌症复现。因此，一旦得知个体患过某种类型的癌症并有复发的风险，就可对他们免疫以使其免疫系统准备对抗任何未来出现的癌症。本发明提供一种治疗患有过度增殖性疾病的个体的方法。在此类方法中，引入的遗传构建体担当免疫治疗剂，引导和促进个体的免疫系统对抗产生靶蛋白的过度增殖性细胞。本发明提供一种治疗患有自身免疫疾病和病症的个体的方法，所述方法赋予对与自身免疫相关的标靶(包括细胞受体和产生针对“自身”的抗体的细胞)的广泛保护性免疫反应。T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、干燥综合征(Sjogren' s syndrome)、肉样瘤病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、強直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener, s granulomatosis)、克罗恩氏病(Crohn' s disease)和溃瘍性结肠炎。这些疾病各自的特征为T细胞受体结合内源性抗原并且引发与自身免疫疾病相关的炎症级联。对T细胞可变区的接种将引出包括CTL的免疫反应以消除那些T细胞。在RA中，涉及所述疾病的T细胞受体(TCR)的ー些特定可变区已得到表征。这些TCR包括V. β.-3、νβ.-14、20ν. β . _17和Va_17。因此，用编码这些蛋白质的至少ー种蛋白质的DNA构建体接种将引出靶向涉及RA的T细胞的免疫反应。參见H0Well，M.D.等，1991Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 :10921-10925 ；Piliard, X.等，1991 Science253 :325-329 ；ffilliams,ff. V.等，1992 J Clin. Invest. 90 :326-333 ;将各參考文献以引用方式并入本文。在MS中，涉及所述疾病的TCR的ー些特定可变区已得到表征。这些TCR包括VfP和Va-IO。因此，用编码这些蛋白质的至少ー种蛋白质的DNA构建体接种将引出靶向涉及MS的T细胞的免疫反应。參见Wucherpfennig, K. W.等，1990Science 248 :1016-1019 ；0ksenberg,J. R.等，1990 Nature 345 :344-346 ;将各參考文献以引用方式并入本文。
在硬皮病中，涉及所述疾病的TCR的ー些特定可变区已得到表征。这些TCR包括V. β·-6、ν· β·-8、ν· β ·-14 和 Va-16、Va-3C、Va-7、Va-14、Va-15、Va-16、Va-28 和 Va-12。因此，用编码这些蛋白质的至少ー种蛋白质的DNA构建体接种将引出靶向涉及硬皮病的T细胞的免疫反应。为了治疗患有T细胞介导的自身免疫疾病的患者，尤其是患有所述TCR的可变区尚待表征的疾病的患者，可以进行滑膜活检。可获取存在T细胞的样品并使用标准技术鉴定那些TCR的可变区。可以使用这种信息来制备遗传疫苗。B细胞介导的自身免疫疾病包括狼疮(SLE)、格雷夫斯氏病(Grave, s disease)、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫血小板減少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆管硬化和恶性贫血。这些疾病各自的特征为抗体结合内源性抗原并且引发与自身免疫疾病相关的炎症级联。对抗体可变区的接种将引出包括CTL的免疫反应以消除产生抗体的那些B细胞。为了治疗患有B细胞介导的自身免疫疾病的患者，必须鉴定涉及自身免疫活动的抗体的可变区。可进行活检并且可获取存在于炎症部位的抗体样品。可以使用标准技术鉴定那些抗体的可变区。可以使用这种信息制备遗传疫苗。在SLE的情况下，认为DNA是ー种抗原。因此，在将要对SLE免疫的患者中，可以筛选其血清的抗DNA抗体并且可以制备包括编码在所述血清中出现的此类抗DNA抗体的可变区的DNA构建体的疫苗。TCR和抗体的可变区的共同结构特征是众所周知的。通常可按照众所周知的方法来找到编码特定TCR或抗体的DNA序列，这些方法描述于Kabat等1987 Sequence ofProteins of Immunological Interest U. Department of Health and Human services,Bethesda Md.中，将所述參考文件以引用方式并入本文。此外，克隆抗体的功能性可变区的一般方法可以在 Chaudhary, V. K.等，1990 Proc. Natl. Acad Sci. USA87 :1066 中找到，将所述參考文献以引用方式并入本文。除了使用可表达形式的免疫调节蛋白编码序列来改进遗传疫苗之外，本发明还涉及改进的减毒活疫苗和使用重组载体递送编码抗原的外来基因的改进的疫苗。减毒活疫苗和使用重组载体递送外来抗原的疫苗的实例描述于以下美国专利4，722，848、5，017，487、5，077，044、5，110，587、5，112，749、5，174，993、5，223，424、5，225，336、5，240，703,5,242，829,5,294，441,5,294，548,5, 310，668,5, 387，744,5, 389，368、5，424，065,5, 451，499,5, 453，364,5, 462，734,5, 470，734 和 5，482，713 中，将各专利以引用方式并入本文。提供的基因构建体包括编码IL-R15CI或其功能片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接于可以在疫苗中起作用以影响表达的调控序列。将基因构建体合并到减毒活疫苗和重组疫苗中以产生根据本发明的改进的疫苗。本发明提供一种使个体免疫的改进的方法，所述方法包括将基因构建体作为疫苗组合物的部分对个体细胞递送的步骤，所述疫苗组合物包括DNA疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗。基因构建体包含编码IL-15受体α或功能片段的核苷酸序列并且可操作地连接于可以在疫苗中起作用以影响表达的调控序列。所述改进的疫苗产生增强的细胞免疫反应。
实施例将小鼠用pIL-15和pIL_15Ra共同免疫以测定使用HIV-1DNA疫苗抗原产生的增强的免疫反应。数据显示，虽然IL-15和IL-15Ra组合确实增强总体的细胞免疫反应，但意外的是，IL-15Ra质粒以IL-15非依赖方式增强免疫反应。重要的是，所诱导的记忆反应仅在用pIL-15以及pIL_15Ra共同接种的小鼠中得到維持，而并不在単独用IL_15Ra接种的小鼠中維持。这些研究首次证明了単独的IL-15Ra蛋白可作为具有有限的免疫扩展表现型的佐剂。材料和方法蛋白质印迹分析根据标准方案进行蛋白质印迹分析。在SDS-PAGE凝胶(Cambrex, Rockland, ME)上操作姆孔3 μ g的重组IL-15R α或VPR蛋白(Abgent),在硝化纤维素膜上进行印迹,并用R&D或KKl. 23抗人IL-15Ra抗体探測。使用抗小鼠IgG-HRP(Zymed)将信号扩增并用ECL(GEHealthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom)检测。DNA 质粒如先前描述制备表达HIV-Igag 和 HIV-lpol (Kim 等，1998)和人 IL-15 (Kutzler等，2005)的DNA疫苗构建体。将人IL-15R α的开放阅读框架移动到pVAXl和pTRACER载体中(Invitrogen, Carlsbad, CA)。分别使用 EcoRI 和 BamHI 或 NheI 和 EcoRI (New EnglandBiolabs, Beverly, MA)进行限制性内切酶消化。通过序列分析检验阳性克隆。活体外翻译试验使用TNT-T7 Quick Coupled Transcription/Translation Reticulocyte Lysate系统(Promega，WI)和[35S]甲硫氨酸来产生标记的IL-15Rα蛋白产物。根据由制造商提供的说明书，将单独的PVAX载体(阴性对照)或含有IL-15Ra和[35S]甲硫氨酸的pVAX载体加入反应混合物中。将反应在30°C下进行I小吋。在RIPA缓冲液中，使用5 μ g纯化的单克隆抗IL-15Ra抗体(R&D Systems)或克隆KKl. 23将标记的蛋白质在4°C下旋转免疫沉淀过夜。向各免疫沉淀反应中加入大约5mg蛋白质G-Sepharose珠(GE Healthcare)(50 μ L的100mg/mL储备液)，并将样品在4°C下旋转孵育2小吋。将珠粒用含有高盐和牛血清白蛋白的结合缓冲液洗涤三次，并最终混悬在2x样品缓冲液中。通过煮沸5分钟将免疫沉淀蛋白质复合物从琼脂糖凝胶珠上洗脱，并在12% SDS-PAGE凝胶(Cambrex)上操作。将凝胶固定并用扩增溶液(GE Healthcare)处理,并且在凝胶干燥器(Bio-Rad,Hercules,CA)中干燥2小吋。将干燥的凝胶在-80°C下暴光于X-射线胶片并使用Kodak自动显影剂(Kodak, Rochester, NY)显影。间接免疫荧光试验用于确认pIL-15Rci质粒表达的间接免疫荧光试验是通过以下的先有技术描述(Ramanathan 等，2002)方案来进行。使在玻片腔室(BD Biosciences, Bedford, MA)中，在完全的 DMEM 加上 10% FBS (Hyclone, Logan, UT)和抗菌-抗霉(GIBC0, Invitrogen,Carlsbad, CA)中，以每腔室100，000个细胞的密度生长的HeLa细胞(ATCC，Rockville,MD)附着过夜。根据制造商的方案，使用FuGENE 6转染试剂(Roche Diagnostics, Basel,Switzerland)将细胞用pIL_15R a-pTRACER或pVAX-1 (I μ g/孔)转染。转染之后二十四小时，用PBS洗涤细胞并在室温下使用2% PFA/PBS在载玻片上固定I小吋。在37度下， 将载玻片用在我们实验室制备的5ug克隆KKl. 23小鼠抗人IL-15Ra或IgGl同种型对照(R&D systems, Minneapolis, MN)孵育90分钟。以I : 200添加抗小鼠IgG-若丹明共轭的ニ级抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)并将载玻片在室温下孵育45分钟。随后,在室温下DAPI (Molecular Probes, Invitrogen)染色10分钟,将载玻片安放在Fluoromount G 培养基(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)上并使用用于突光显微镜检查的 Phase 3 Image Pro Program (Media Cybernetics, Bethesda, MD)分析。质粒免疫和小鼠6 至 8 周大的雌性 BALB/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)、C57BL/6 (Taconic, Germantown, NY)或 IL-15 敲除(Taconic) (Kennedy 等，2000)小鼠进行胫骨前肌肉注射3次，每次相隔2周，并如先前描述(Khan等，2003 ；Laddy等，2008)，使用CELLECTRA 适配的恒流装置(VGX Pharmaceuticals,The Woodlands,TX)进行电脉冲。对所有小鼠实验来说，所述动物均用35ug pVAXl>5 μ g HIV-1抗原质粒(gag, pol)、10 μ gpIL-15和/或7. 5、10或15yg pIL_15Ra (η = 3-7只每组)免疫。各种基因质粒的共同施用涉及在以等渗柠檬酸盐缓冲液(Kim等，1998 ;Kutzler等，2005)中的0.25%布比卡因-HCL(Sigma)注射之前，将指定的DNA质粒混合至40 μ I的最终体积。所有动物均圈养在宾夕法尼亚大学的温度受控、光照循环的设施中，并且按照美国国家卫生研究所和宾夕法尼亚大学的指导对它们进行照料。小鼠处死、样品采集和组织获取的方法在免疫程序指定的时间点，使用止痛药将动物镇静并采集血液，之后通过颈部脱位将动物处死。从各个小鼠获取脾脏并汇集(每个实验组)到含有RlO培养基(RPMI1640加10%胎牛血清、抗菌/抗霉和B-巯基こ醇)的15ml锥瓶中。在无菌组织培养罩中，使用stomacher装置(Seward 80, Metrohm, Riverview, FL)将来自各个实验组的汇集的脾脏/培养基混合物挤进单细胞混悬液中。使细胞/组织基质通过40-微米细胞过滤器并用RlO洗漆，造粒并在室温下，在ACK裂解缓冲液(Lonza, Switzerland)中孵育5分钟以使红细胞裂解。随后将脾细胞计数并用于以下描述的免疫试验中。 IFN- Y ELISP0T 试验
如先前描述(kutzler等，2005)进行IFN-yELISPOT以测定来自免疫小鼠的抗原特异性细胞因子分泌。简单地说，用抗小鼠IFN-Y俘获抗体接种ELISpot 96孔板并在4°C下孵育24小时(R&D Systems)。将来自免疫小鼠的2x105个脾细胞加入ELISpot板的各个孔中并在37°C、5% C02，在RlO(阴性对照)、伴刀豆球蛋白A(阳性对照)或特异性肽(HIV-Igag或pol)抗原(10yg/ml)存在下刺激过夜。跨越整个相应蛋白质(11个氨基酸重叠)的 HIV-1 Consensus Clade B 亚型 HIV-1 gag 和 pol 15_mer 妝是从 AIDS Reagentand Reference Repository (Frederick, MD)获得。对于⑶8缺失实验来说，根据制造商的方案，通过使用抗⑶8a(Ly-2)抗体(Miltenyi Biotech, Germany)的阳性磁性分选,将CD8+T细胞从全部脾细胞中除去。刺激24小时之后，将板洗涤并在4°C下用生物素化的抗小鼠IFN-Y抗体(R&D Systems)孵育过夜。将板洗漆并在室温下用链霉亲和素碱性磷酸酶(R&D Systems)孵育2小吋。将板洗涤，添加5-溴-4-氯-3’吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(BCIP)和氯化硝基四氮唑兰(NBT) (the Chromogen Color Reagent,R&D Systems)。将板用蒸懼水冲洗，并在室温下干燥。用自动化ELISpot读数器(CTL Limited, Inc. Cleveland,OH)将斑点计数。測定原始数值并乘以系数五，以使数据表示为每百万脾细胞的斑点形成细胞。在绘图之前，将在各组的RlO孔中的背景值从肽刺激的孔的值中减去。 还通过使用Cytof ix/Cytoperm Kit和标准方案(BD Biosciences)的细胞内细胞因子染色来測定细胞内细胞因子染色HIV-I特异性T细胞反应。将来自免疫小鼠的脾细胞在具有 RlO 和 DMSO (阴性对照)的 lul/ml GolgiPlug (BD Biosciences)、10ng/ml PMA 和250ng/ml离子霉素(阳性对照)或HIV-1 consensus Clade B gag或pol I5Ier肽存在下刺激5小时。在表面染色之前，在37°C下用LIVE/DEAD可固定的紫罗兰试剂盒(MolecularProbes, Invitrogen)将细胞染色10分钟,并在4°C下经过15分钟添加Fe封闭剂(BD)以封闭Fe受体。所有抗体均购自BD Biosciences并且以Iul/测试使用。在透化/固定之前，在4°C下将细胞用⑶4-Alexa700和⑶8-PerCP染色30分钟。在4°C下，在细胞内染色的 45 分钟中包含 CD3-PECy5 和 IFN- y PE_Cy7。使用 LSRII 流式细胞仪(BD Biosciences)获得来自50，000活的CD3+淋巴细胞门控事件(gated event)的数据并且使用Flowjo软件(Treestar, Inc. , Ashland, OR)分析。在绘图之前,将来自阴性对照孔的反应从抗原刺激中减去。HIV-IGag结合抗体的分析如(Ogawa等，1989 ；Mestecky等,2004)所述，将ELISA用于测定小鼠血清中的 HIV-1 Gag-特异性抗体 IgG。将 EIA/RIA 板(Corning Costar, Cambridge, MA)用以IOOul 姆孔的最终体积稀释在 PBS (Mediatech, Herndon, VA)中的 I μ g/ml 重组 HIV-1IIIBgag p24(Immunodiagnostics, Woburn, MA)来接种并在 4 °C 下孵育过夜。将板用 PBS/Tween (O. 05% Tween 20)洗涤并在室温下用200 μ I封闭缓冲液/稀释剂(PBS中3% BSA)对非特异性结合封闭2小吋。将板洗涤并分三次添加从免疫小鼠汇集的血清的稀释液(100 μ I每孔)，稀释度为I至10到I至1600，并且在室温下孵育2小时。用辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) (Zymed)检测结合抗体并用底物ΤΜΒΗ202 (Sigma-Aldrich)显影。用 2Ν H2S04 将显色反应终止，在 EL312Bio_Kinetics 微板读数器(Bio-Tek InstrumentsInc. , Winooski, VT)中读取在450nm处的吸光度。结果
抗人IL_15Ra抗体的产生产生对人IL-15Ra的单克隆抗体，因为市售的抗体缺乏检测IL_15Ra质粒(pIL_15Ra)在细胞上表达的能力。重组人IL_15Ra是如下产生的重组人IL_15Ra蛋白是由Abgent (San Diego, CA)产生。将人IL_15Ra的开放阅读框架(是由Thomas Waldmann (NCI, NIH, Bethesda, MD)康慨赠送)克隆到高度表达的细菌载体pET21a(EMD Biosciences, Gibbstown, NJ)中。将感受态细胞转化，在大肠杆菌中扩增，并使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白质。通过直接ELISA，使用抗人IL-15Ra抗体(R&DSystems, Minneapolis, MN)精确确认纯化蛋白质。为了确认新产生的IL-15Ra蛋白的大小，在SDS-PAGE凝胶上操作纯化蛋白质的稀释度逐渐减小的稀释液并用考马斯蓝染料染色(图1A)。如图IA所示，产生的蛋白质大约是30kDa，即预期的大小。测试此蛋白质结合市售抗体的能力，以作为其正确完整性的指标。图IB展示ELISA试验，由重组IL-15Ra或VPR蛋白(阴性对照)俘获板。使用的VPR是通过与IL-15Ra蛋白类似的方法来产生。图IB展示市售抗人IL-15Ra抗体可检测产 生的重组蛋白质。为了产生对IL_15Ra的抗体，如图IC并且如下将重组人IL-15Ra蛋白注射到BALB/c小鼠中将重组人IL_15Ra蛋白质注射到BALB/c小鼠(η = 4)中以产生单克隆抗体。每次注射(Sigma，St. Louis,MO)给于在完全弗氏佐剂(仅第一次免疫)或不完全的弗氏佐剂(随后的免疫)中乳化的总共5yg蛋白。向各侧腹皮下注射50 μ I井向腹膜注射100 μ I。在融合之前三天，对小鼠静脉内给于35ug蛋白质的无菌PBS终点加强剂(final boost)。通过直接ELISA，使用重组IL-15Ra蛋白和抗小鼠IgG-HRP (Zymed，San Francisco, CA)测定血清中的抗体水平。将具有对IL-15Ra的抗体的I : 8，000效价的一只小鼠处死，将其脾脏除去用干与骨髓瘤细胞系融合。通过ELISA筛选1，500个杂交瘤上清液，扩增8个阳性克隆，并将ー个克隆通过硫酸铵柱纯化，其为抗体KKl. 23。由Wistar Institute HybridomaFacility (Philadelphia, PA)的 Julia Conicello 负责产生并纯化单克隆抗体。通过ELISA筛选大约1，500个杂交瘤上清液之后，如图ID所示，一个杂交瘤KKl. 23显示抗体的效价(> I至12，800)。随后将此杂交瘤克隆、扩增并纯化。如图IE中的蛋白质印迹分析所示，纯化的抗体KKl. 23对人IL-15Ra是特异性的。此外，KKl. 23似乎以比市售抗体更高的亲合力与人IL-15Ra结合(图1E)。pIL-15Ra表达生物活性蛋白质产生适用于接种研究的IL-15Ra表达载体。如图2A所示，在CMV启动子的控制下，将人IL_15Ra0RF克隆到pVAXl表达载体中。为了评价IL_15Ra质粒的适当的表达，进行活体外翻译试验。在图2B&2C中展示S35放射性标记的蛋白质，以大致30. OkD迁移，而对照质粒PVAX与预期的一样不产生任何可检测的蛋白质产物。针对人IL-15Ra的商业化R&D(2B)或KKl. 23(2C)抗体用于使放射性标记的蛋白质免疫沉淀。为了确认质粒IL-15Ra的表达，使用来自上述实施例I的KKl. 23抗体进行免疫荧光试验。将人IL-15Ra的ORF克隆到pTRACER表达载体中，所述载体也编码绿色荧光蛋白质(GFP)报告基因。因此，发绿色荧光的细胞(图2E-G)也表达pIL-15Ra。使用抗小鼠IgG-PE(Red)检测KKl. 23抗人IL_15Ra。图2D中展示未转染的对照，而图2E中展示同种型对照。数据说明pIL-15Ra质粒表达的能力以及抗人pIL-15Ra抗体检测翻译的蛋白质产物的能力。pIL_15Ra质粒编码构型精确的和表面定位的蛋白质。组合pIL-15和pIL_15Ra作为佐剂为了研究pIL_15Ra与pIL_15相比增强免疫反应的能力，根据图3A中展示的程序，对BALB/c小鼠进行胫骨前肌内免疫并伴随进行体内电穿孔。用pVAX对照载体或具有 IOyg pIL-15、15yg pIL_15Ra 或 pIL-15 和 pIL_15Ra 两者的 5yg 抗原构建体(HIV-lgag，HIV-lpol)，以40ul的最终体积将小鼠免疫。预先测定这些剂量以在初歩研究中得到最佳的反应(数据未展示)。如图3B所示，如通过IFN-YELISpot的測量，用単独的抗原构建体的免疫产生2，300个斑点形成细胞(SFC)/106脾细胞。pIL-15的添加增强反应至3，800个SFC的，而用pIL-15Ra和PIL_15共同免疫显示超过单独的抗原组的最显著增カロ，产生5，900个SFC。这些结果支持了 IL-15/IL-15Ra免疫复合物的形成可担当比单独的IL-15更有效力的佐剂的观点。 为了确定是否在体内真实地形成了这种免疫复合物，増加了另ー个免疫组，其中在不同的腿中注射PIL-15和pIL-15Ra (具有抗原)。在这种分开的递送方法中，质粒递送的IL-15和IL-15Ra不可能形成免疫复合物。发现在不同腿中的pIL_15和IL_15Ra的共同免疫引出与在同一腿中递送相同组合所观测的类似的IFN-Y水平(分别是4，562对4，072 SFC)。应注意，用抗原构建体和pIL-15R a的免疫组也增强抗原特异性IFN- Y分泌，达到大约3500个SFC(图3B)。为了确认这些结果，我们用逐渐增加剂量的pIL_15R a质粒连同抗原构建体对ー个新的小鼠组进行免疫，以观察pIL-15Ra是否会以剂量依赖方式诱导反应。如图4所示,在测量的对pGag(视图A)或pPol (视图B)的反应中,pIL_15R α的包括确实以剂量依赖方式增强所诱导的IFN-γ的分泌。不考虑所使用的HIV-I抗原构建体，在使用的最高剂量下，用pIL_15Ra的共同免疫使细胞免疫反应增强I. 5至2倍。注意，即使在不存在IL-15，IL-15Ra似乎仍增强抗原特异性免疫反应。为了进一步确认pIL_15Ra的佐剂性质，研究了接种之后的⑶4+和⑶8+T细胞的效应子功能。在进行IFN-Y ELISpot试验之前，从用先前提到(上文)的各种疫苗组合免疫的小鼠的脾细胞中除去⑶8+T细胞。如图5A所示，从用pIL-15、pIL-15Ra或两者的组合免疫的小鼠的脾细胞除去CD8+T细胞显著地降低检测到的IFN-Y分泌的量。与在全脾细胞中观测的总反应(黒色条形图)相比，在任何免疫的组中的CD4+T细胞贡献(灰色条形图)之间没有差异。综合来看，接种策略中的pIL-15Ra和pIL-15的组合比单独递送任何ー个构建体大大地增强免疫反应。这种累加效应主要作用于⑶8+T细胞，因为所述效应随着此细胞群体的除去而损失。为了确定pIL_15Ra是否也会对体液免疫反应有作用，也通过ELISA測定了由各种接种策略引出的抗体反应。对来自免疫小鼠的血清进行试验以测定针对HIV-1 Gag(p24)蛋白的IgG抗体的水平(图5B)。虽然pIL-15和pIL-15Ra的组合对于引出细胞免疫性是最好的，但是与用PVAX(未检测)、単独的pGag或组合(I 800)免疫的小鼠相比，用単独的pIL-15或pIL-15Ra免疫的小鼠具有HIV-I特异性抗体的最高效价(I 1600)。pIL-15Ra佐剂似乎不增强CD8+T细胞记忆如本文先前所述,将小鼠免疫三次；然而，并不在第三次免疫后一周处死这些动物，而是使它们静养大约30周，以确保观测的反应将主要归因于记忆群体。如图6A所示，一段显著的静养期之后的反应仍然十分強。用単独的抗原构建体免疫的小鼠具有1700个SFC左右的反应。最高的反应明显在用pIL-15免疫的小鼠组中，对于pIL-15和pIL-15/pIL-15Ra组合来所，都是约2800个SFC。在没有pIL_15的情况下用pIL_15Ra共同免疫的小鼠中，不再观测到佐剂影响(约1700个SFC)。也通过细胞内细胞因子染色和流式细胞术观测到相同的趋势(图6B)，其中由CD8+T细胞产生的IFN-Y的水平在用pIL_15共同免疫的小鼠中最突出。观测到在接种策略中添加pIL-15Ra对记忆反应几乎不具有作用，而观测到pIL-15具有大的作用。因此，支持了以下理论虽然pIL-15Ra在接种之后初期是强的佐剂，但是随着时间的过去IL-15似乎是记忆CD8+T细胞的较佳诱导物。记忆抗体反应类似于在效应期期间观测到的反应。如图6C所示，用pIL-15免疫的小鼠在I : 1600的稀释度下具有可检测的对HIV-lGag(p24)的抗体，而包括pIL-15/pIL-15Ra的组合的所有其它的组，在I : 400稀释度下就具有可检测的对HIV-IGag(p24)的抗体。虽然显示pIL-15在体液的产生以及细胞记忆反应中是有效的佐剂；但另一方面，PIL-15Rα似乎也在加快对抗原的急性免疫反应中发挥作用。无IL-15 的 pIL_15Ra 佐剂为了测试人IL_15Ra蛋白是否可通过与内源性鼠IL-15形成复合物或不依赖于IL-15来增强接种小鼠的免疫反应，在IL-15敲除的小鼠中进行接种研究。最初，作为对照，测试了翻译的人IL-15Ra蛋白与小鼠IL-15的结合。如图7A所示，用鼠IL-15孵育的S35放射性标记的人IL-15Ra蛋白能够与抗小鼠IL-15 —起抗体免疫沉淀，暗示鼠IL-15与人IL-15Ra结合的能力。研究了在没有鼠IL-15的情况下，pIL_15Ra的辅佐能力。因此，在IL-15敲除的小鼠中进行了相同的接种研究，所述小鼠缺乏内源性IL-15并且因此在NK和记忆⑶8+T细胞中具有缺陷(Kennedy等，2000)。图7C展示，如通过IFN- y ELISpot的测定在所述敲除小鼠中，没有内源性鼠IL-15的情况下，pIL-15Ra辅佐了免疫反应。此外，pIL_15和pIL-15Ra的组合未能进ー步增强最初在BALB/c小鼠中观测到的由于单独施用任何ー种佐剂的免疫反应。IL-15-/-小鼠是在来自Taconic的C57/BL6基础上产生。因此，为了进行核实，我们在适当的背景对照小鼠中获得如在BALB/c中观测到的类似的反应，重复相同的试验。图7B展示来自用相同的程序的免疫的对照小鼠的结果并且显示出与BALB/c免疫小鼠相同的趋势。结论IL-15RQ构建体连同人IL-15和HIV-I抗原DNA构建体的共同免疫比单独用抗原构建体的免疫产生大2. 5倍效カ的IFN- Y分泌水平(图3B)。IFN- Y分泌可归因于⑶8+T细胞，因为在接种到ELISpot之前除去这些细胞会导致少10倍的IFN-Y分泌。使用IL-15/IL-15RQ的组合递送时，观测到的效价的増加不可能是由于在转染的细胞中形成了稳定的复合物，因为向不同的腿(具有抗原)中注射这些pIL-15和pIL-15Ra也引出与在相同的腿中递送时类似的免疫反应。因此，使用pIL-15/pIL-15Ra的共同递送时观测到的增强的反应更有可能是两种独立的佐剂的累加效应。如通过对血清中的IgG抗体的測定，这两种佐剂的共同递送似乎不会进一步增强体液免疫反应。也研究了组合的pIL-15/pIL_15Ra对免疫反应的长期作用。为了观测记忆反应，在进行免疫分析之前，允许在第三次免疫之后经过30周。结果显示，虽然这两种佐剂的组合在免疫反应初期引出有效カ的CD8+T细胞反应，但是对记忆T细胞的作用主要仅在ー起使用PIL-15免疫的小鼠中观测到。与単独的抗原相比，增强的记忆免疫反应需要包括pIL-15。类似地，IL-15RQ最初引出的免疫反应等于或大于IL-15引起的免疫反应，但其对维持记忆反应没有帮助。因此，虽然IL-15RCI扩展了反应爆发量(burst size)，但是在没有记忆IL-15信号的情况下的释放量不足以维持长期反应。在一次意外的观测中，具有pIL_15Ra的抗原质粒的递送也增强细胞免疫反应，并且等于由pIL-15引出的免疫反应。为确认，用逐渐增加量的pIL-15Ra进行免疫并且观测到剂量依赖反应。可能是人IL-15Ra蛋白能够与内源性鼠IL-15结合并且以类似方式将其转呈，因为鼠IL-15与人IL-15约73%—致(Anderson等，1995a)。为了检验此假设，将缺乏任何内源性IL-15的IL-15敲除的小鼠免疫。与单独的抗原相比，在用pIL-15Ra免疫的IL-15敲除的小鼠中观测到大约2倍増加。由于难于大量地获得在6-8周龄之间的IL-15-/-雌性小鼠，在这些实验中排除了 pIL-15组。然而，不再观测到pIL-15/pIL-15Ra的组合的增强效应。应注意，对照C57/BL6小鼠显示出在BALB/c小鼠中看到的相同的趋势 (虽然PVAX组的总斑点数较低和背景值更高)，甚至与C57/BL6小鼠相比，IL-15敲除的小鼠的反应总体更低。先前描述这些小鼠具有些许缺陷型宿主防御反应，包括不能保护免受牛痘攻毒(Kennedy等，2000)。不考虑总体较低的免疫反应，在没有任何内源性IL-15的情况下，仍然观测到pIL-15Ra的辅佐效应。虽然不希望受理论束缚，但从对结果全面补充考虑，认为IL-15Rci可担当能够引出不依赖于IL-15的反应的新颖佐剂。这种免疫反应增强似乎特别地集中在宿主T细胞反应的急性期而非记忆期期间的免疫扩展上。參考文献AMARA, R. 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权利要求
1.一种组合物，其包含编码免疫原的分离的核酸分子；和编码IL-15RCI或其功能片段的分尚的核酸分子。
2.根据权利要求I所述的组合物，其中所述免疫原是病原体抗原、癌症相关的抗原或与涉及自身免疫疾病的细胞相关的抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫原是来自引起慢性感染的病原体的病原体抗原。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述编码IL-15RCI的分离的核酸分子包含编码IL-15Ra的核酸编码序列，所述IL_15Ra具有如SEQ ID NO :1所述的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其进ー步包含编码IL-15或其功能片段的核酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述核酸分子是质粒。
7.—种可注射的药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的组合物。
8.一种诱导个体对免疫原的免疫反应的方法，其包括对所述个体施用根据权利要求1-7中任一项所述的组合物。
9.ー种重组疫苗，其包含编码可操作地连接于调控元件的免疫原的核苷酸序列和编码IL-15Ra或其功能片段的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的重组疫苗，其中所述免疫原是病原体抗原、癌症相关的抗原或与涉及自身免疫疾病的细胞相关的抗原。
11.根据权利要求10所述的重组疫苗，其中所述免疫原是来自引起慢性感染的病原体的病原体抗原。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的重组疫苗，其中编码IL-15Ra的所述分离的核酸分子包含编码IL-15Ra的核酸编码序列，所述IL-15Ra具有如SEQID NO 1所述的序列。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的重组疫苗，其进ー步包含编码IL-15或其功能片段的核酸序列。
14.一种诱导个体对免疫原的免疫反应的方法，其包括对所述个体施用根据权利要求9-13中任一项所述的重组疫苗。
15.—种活减毒病原体,其包含编码IL_15Ra或其功能片段的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的活减毒病原体，其中所述病原体是引起慢性感染的病原体的减毒株。
17.根据权利要求15或16中任一项所述的活减毒病原体,其中编码IL-15Ra的所述核酸编码序列是SEQ ID NO =I0
18.根据权利要求15-17中任一项所述的活减毒病原体，其进ー步包含编码IL-15或其功能片段的核酸序列。
19.一种诱导个体对免疫原的免疫反应的方法，其包括对所述个体施用根据权利要求15-18中任一项所述的活减毒病原体。
20.ー种核酸分子，其包含具有IL-15Ra免疫调节功能、IL-15结合功能、与IL-15受体复合物的其它亚单位结合的功能或其组合的SEQ ID NO :1或其片段。
全文摘要
公开了包含编码免疫原的一种或多种分离的核酸分子连同编码IL-15Rα或其功能片段的分离的核酸分子的组合物、重组疫苗和活减毒病原体。公开了使用此类组合物诱导个体对免疫原的免疫反应的方法。
文档编号A61K39/00GK102821790SQ201080040593
公开日2012年12月12日 申请日期2010年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者D·B·韦纳, K·A·克赖尼亚克, M·库兹勒 申请人:宾夕法尼亚大学托管会